海藻酸鋅納米凝膠超聲霧化吸入安全性評價*

岳曉月，吳佳蓉，王艷秋，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

近年來，納米藥物制劑在基礎(chǔ)研究和臨床實踐中展現(xiàn)出巨大的潛力。納米凝膠作為一種新型的給藥系統(tǒng)，一般是指直徑在200 nm以下的水凝膠，其本體是一種三維網(wǎng)狀聚合物水凝膠。由于其較大的比表面積更有利于攜帶藥物富聚集于病灶，且能顯著提高藥物的生物利用度[1-2]。同時，納米凝膠具有普通凝膠體系具有的穩(wěn)定性、控釋性，有利于降低藥物的毒副作用[3-6]。此外，有研究表明納米凝膠，特別是表面進行聚乙二醇（PEG）化修飾的的納米凝膠，可減少其被體內(nèi)免疫系統(tǒng)的吞噬細胞作為異物識別和吞噬，可以降低納米凝膠體系的免疫原性、增強其載體的穩(wěn)定性，進而延長藥物于體內(nèi)的滯留時間，具有長循環(huán)效果，是藥物輸送的理想載體[7]。霧化吸入是目前治療慢性阻塞性肺病、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的常用給藥途徑，具有用藥劑量小、操作簡便、起效快、有效避免肝臟首過效應(yīng)和不良反應(yīng)少等優(yōu)勢[8]。海藻酸鈉在水溶液中易與二價金屬陽離子交聯(lián)形成凝膠，且具有良好的生物相容性[9-11]。

本研究結(jié)合海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)特點，以氯化鋅作為交聯(lián)劑，采用反相微乳法制備海藻酸鋅納米凝膠（ALG-NPs），后期將作為藥物的輸送載體，本著嚴謹?shù)目蒲袘B(tài)度，有必要對其超聲霧化吸入的安全性和可行性進行初步探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 實驗動物為健康SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g，雌雄各半，購于北京維通利華動物實驗中心[動物合格證編號：SCXK（京）2016-0006]。實驗動物于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)，保持自由飲水和進食，環(huán)境溫度為（24±1）℃，濕度為55%±5%，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行實驗，每只動物僅使用1次。動物實驗遵循美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）指導(dǎo)原則和天津中醫(yī)藥大學(xué)的倫理委員會規(guī)定。

1.2 實驗藥品與試劑 海藻酸鈉（細胞培養(yǎng)級）購自Sigma-Aldrich公司。液體石蠟（分析純）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。司盤（Span）80和吐溫（Tween）80購自Sigma-Aldrich公司。氯化鋅（分析純）購自天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠。溴化鉀（光譜純）購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自eBioscience公司。BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo公司。

1.3 實驗儀器 萬分之一精密分析天平，AL204，Mettler-Toledo儀器（上海）有限公司。頂置式電子攪拌器，EURO-STPCV S25，IKA公司。加熱型磁力攪拌器，RCT basic，IKA 公司。精密蠕動泵，BT100-2J，保定蘭格恒流泵有限公司。冷凍干燥機，F(xiàn)DU-2100，EYELA公司。激光粒徑測定儀，Zetasizer Nano-Zs，Malvern公司。透射電子顯微鏡，H-7650，Hitachi公司。差示掃描量熱儀，Jade，Perkin Elemer公司。傅立葉變換紅外光譜儀，Thermo公司。超聲霧化器，402AI，江蘇魚躍醫(yī)療器械股份有限公司。熒光顯微鏡，DM 4000 B，Leica儀器公司。多功能讀板機，Infinite M200，TECAN公司。動物裝置：自制不完全封閉有機玻璃箱，20 cm×13 cm×15 cm，箱體兩端一端為通氣孔，另一端接超聲霧化器。

2 實驗方法

2.1 ALG-NPs的制備 將多功能真空攪拌器與頂置式攪拌機連接固定，于500 mL三頸瓶中分別加入150 mL液體石蠟、1.05 mL Span 80和 0.45 mL Tween 80，于40℃水浴，500 r/min條件下充分分散30 min作為油相。將攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)至1 000 r/min，使用蠕動泵將45 mL濃度為0.5%（W/V）海藻酸鈉溶液緩慢滴入油相中，控制流速0.75 mL/min，滴加完畢后持續(xù)攪拌1 h，使水相與油相充分混勻。使用蠕動泵加入固化劑15 mL（含有0.1%氯化鋅的60%乙醇溶液），控制流速0.15 mL/min，攪拌轉(zhuǎn)速為1 000 r/min，滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h。最后，將圓底燒瓶中液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，稱質(zhì)量，3 800 r/min離心10 min，分離水相得到ALG-NPs，液氮速凍并冷凍干燥保存，備用[12]。

2.2 ALG-NPs表征分析

2.2.1 粒徑及Zeta電位測試 將制得的ALG-NPs溶液稀釋10倍，采用納米粒度儀測定納米凝膠的粒徑及分布和表面Zeta電位，室溫下重復(fù)測定3次，結(jié)果取平均值。

2.2.2 透射電子顯微鏡（TEM）分析 取少量ALGNPs，重懸于超純水中，將懸液滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，室溫晾干，在TEM下觀察納米凝膠的形貌（樣品未經(jīng)任何染色）。

2.2.3 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）分析 將干燥的海藻酸鈉和ALG-NPs分別與KBr混合壓片，以空白KBr片作為對照，在傅里葉變換紅外光譜儀上對樣品的紅外光譜進行測定，設(shè)定波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

2.2.4 差示掃描量熱（DSC）分析 稱取干燥的海藻酸鈉和ALG-NPs 6～8 mg分別置于密閉鋁盤中，以空白鋁盤作為對照，在恒定氮氣流下（20 mL/min），調(diào)節(jié)升溫速度為10℃/min，升溫范圍為30～350℃，記錄各樣品的DSC測定曲線。

2.3 實驗分組及給藥 BALB/c小鼠，體質(zhì)量16～18 g，雌雄各半，共48只，隨機分為4組，分別為空白對照組（Control）、ALG-NPs低（100 mg/kg）、中（150 mg/kg）、高（200 mg/kg）劑量組。每組按取材時間分為7 d、14 d，2個亞組，每個亞組6只。

將各組實驗動物分別放入20 cm×13 cm×15 cm不完全封閉的有機玻璃箱，空白對照組霧化吸入等體積的注射生理鹽水，各給藥組霧化吸入不同濃度的ALG-NPs，20 min/次，每天連續(xù)進行霧化吸入給藥。各組小鼠每次霧化吸入后1 h均進行一般情況觀察。

2.4 總體外觀及行為學(xué)評價 每次ALG-NPs超聲霧化吸入前及給藥后1 h觀察小鼠口、鼻部內(nèi)外的可視范圍內(nèi)有無流血、紅腫、潰瘍等現(xiàn)象，同時觀察ALG-NPs超聲霧化吸入后1 h小鼠全身狀況及局部刺激癥狀（如有無咳嗽、哮喘、窒息、嘔吐等癥狀）。

2.5 血清采集及肺組織取材 各組分別于7、14 d末次霧化吸入后1 h取6只小鼠留取生化及肺組織標(biāo)本。采用摘眼球取血并收集于離心管中，然后于37℃水浴靜置30 min后，3 000 r/min，離心15 min，收集上部血清，棄沉淀，-20℃保存用于相關(guān)細胞因子的檢測。打開胸腔，完整取出小鼠肺部組織并修剪，去除周圍組織及氣管，濾紙吸去殘留血漬，稱取肺組織濕質(zhì)量，計算肺系數(shù)：全肺濕質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。肉眼觀察肺臟大小、顏色及表面病變等。即刻取右肺上葉及同部位氣管、支氣管約0.5 cm小段，放入4%的中性福爾馬林中固定，脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，厚 4 μm，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡下進行小鼠肺組織和氣管組織病理觀察。

2.6 血清及肺組織中IL-6、TNF-α含量測定 按照eBioscience公司IL-6和TNF-α ELISA試劑盒說明書操作，測定血清及肺組織中IL-6和TNF-α的濃度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Origin Pro 8.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并做圖，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準誤（Means±SE）表示，組間比較使用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 ALG-NPs粒徑及Zeta電位 納米粒的粒徑大小及分布是影響粒子分散體系物理穩(wěn)定性的重要因素，粒徑分布通常以多分散性系數(shù)（PDI）評價，一般認為PDI<0.3時，表明該納米粒的粒徑分布均勻，大小均一[13]。ALG-NPs所測定的平均粒徑為（71.24±2.12）nm，PDI為 0.143±0.04，提示其粒徑分布較窄，符合納米制劑的一般要求。

納米粒電位測定是納米粒表面荷電性質(zhì)與荷電大小的標(biāo)志，是影響納米制劑分散性的重要參數(shù)，它不僅影響該類制劑的物理穩(wěn)定性，而且往往影響載藥納米粒的體內(nèi)分布與體內(nèi)藥物動力學(xué)[14]。帶負電荷的納米粒進入體內(nèi)后可防止納米粒在血液中凝聚，避免非特異性清除，具有一定的長循環(huán)效果。實驗中制備的ALG-NPs所測定的平均Zeta電位為（-19.4±0.64）mV，提示其不易發(fā)生聚集，帶負電荷，可減少與血漿蛋白的結(jié)合，提高ALG-NPs在血液中的循環(huán)時間。

3.2 ALG-NPs外觀及微觀結(jié)構(gòu)與形貌 ALGNPs為半透明略帶乳光液體，肉眼觀察未見不溶性成分或絮凝樣聚集物。

ALG-NPs的透射電鏡照片如圖1所示，可見ALG-NPs形態(tài)圓整呈類球形，無粘連，表面光滑，電鏡測定的粒徑與激光粒徑測定儀所測得的結(jié)果一致。

圖1 ALG-NPs透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 The TEM microphotographs of ALG-NPs

3.3 FT-IR分析結(jié)果 樣品的紅外光譜譜圖如圖2所示。海藻酸鈉含有大量的羥基，羥基是強極性基團，易與供電子基團（如氨基、羥基、羰基等）形成氫鍵。隨著氫鍵締合程度的加強，O-H伸縮振動頻率大幅度降低，譜帶加寬，強度增加。海藻酸鈉分子結(jié)構(gòu)中，羥基主要形成了多締合體，從而在3 426 cm-1處形成了強而寬的υ（O-H）吸收峰，在1 033 cm-1處為羥基的C-O伸縮振動吸收峰，1 608 cm-1和1 413 cm-1處分別為羧酸根負離子的伸縮振動（υcoo-）和不對稱伸縮振動（υascoo-）[15]。ALG-NPs在 3 421 cm-1處為O-H伸縮振動吸收峰υ（O-H），與海藻酸鈉O-H伸縮振動吸收峰υ（O-H）相比，其向低波數(shù)區(qū)移動，分析可能是由于替代鈉離子形成ALG-NPs后，海藻酸結(jié)構(gòu)單元與二價鋅離子形成配位結(jié)構(gòu)，降低了O-H的鍵能和氫鍵的締合程度；2 925 cm-1、2 855 cm-1處為-CH2亞甲基的不對稱伸縮振動峰（υasC-H）和對稱伸縮振動峰（υC-H）；與海藻酸鈉分子中羧基特征峰（1 413 cm-1）相比，ALG-NPs中其吸收峰（1 457 cm-1）發(fā)生了紅移，分析其可能是由于二價鋅離子與海藻酸分子中羧基相互作用的結(jié)果。

圖 2 ALG-NPs（a）、海藻酸鈉（b）的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FT-IR transmission of ALG-NPs（a）and sodium alginate（b）

3.4 DSC分析結(jié)果 樣品的差示掃描量熱圖如圖3所示。海藻酸鈉在120℃附近出現(xiàn)了較寬的吸熱峰，此為海藻酸鈉內(nèi)部結(jié)合水的失去，在245℃附近有一個尖銳的放熱峰，對應(yīng)著海藻酸鈉的熱分解[16]。在ALG-NPs譜圖中，海藻酸鈉在245℃處的放熱峰移至250℃附近且其強度明顯減弱，這可能是由于海藻酸分子與二價鋅離子交聯(lián)形成ALG-NPs，使分子熱穩(wěn)定性提高。

3.5 小鼠一般狀態(tài)觀察結(jié)果 各組小鼠均較活潑，毛發(fā)光潔，呼吸平穩(wěn)，反應(yīng)敏捷，未出現(xiàn)呼吸急促、精神不振和反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象，且均未出現(xiàn)激惹、飲食飲水減少以及便溏等表現(xiàn)。給藥前及給藥后1 h各組小鼠口、鼻部外的可視范圍內(nèi)均未出現(xiàn)紅腫、流血、異常分泌物、潰瘍等現(xiàn)象。與空白對照組比較，ALG-NPs各劑量組小鼠體質(zhì)量未見明顯異常。

圖 3 ALG-NPs（a）、海藻酸鈉（b）的差示掃描量熱圖Fig.3 DSC thermograms of ALG-NPs（a）and sodium alginate（b）

3.6 小鼠肺組織病理解剖觀察結(jié)果 如圖4所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，各組小鼠雙肺外觀形態(tài)無明顯差異，均呈淡粉色，表面光滑，觸之柔軟，彈性好。與給藥7 d后的各組小鼠肺組織相比，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d的各組小鼠雙肺稍皺縮，彈性尚可，但ALG-NPs高劑量組雙肺部分區(qū)域呈暗紅色，有炎癥發(fā)生。

圖4 小鼠肺組織病理解剖照片F(xiàn)ig.4 Pathological anatomic photographs of lung tissue in mice

3.7 肺組織及氣管顯微病理學(xué)觀察結(jié)果 如圖5所示，空白對照組小鼠終末支氣管及細支氣管管腔光滑，上皮完整，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄且肺泡間隔正常，管壁及肺泡壁無炎性細胞浸潤或明顯滲出性改變。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，ALGNPs組小鼠肺組織病理學(xué)特征與空白對照組基本一致，未見明顯異常改變。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d后，ALG-NPs高劑量組肺泡腔及間質(zhì)偶有炎性細胞浸潤，但肺泡結(jié)構(gòu)正常。ALG-NPs低劑量及中劑量組小鼠肺組織病理學(xué)特征與空白對照組基本一致。

圖5 小鼠肺組織顯微病理照片（×200，標(biāo)尺：200 μm）Fig.5 Micropathological photos of the lung tissue in mice（×200，scale bar：200 μm）

如圖6所示，空白對照組小鼠氣管病理切片顯微照片可見氣管黏膜清楚分為黏膜層、黏膜下層和外膜層，管腔呈圓形，且未見內(nèi)陷、閉塞、狹窄、異常增生物或分泌物等。黏膜層由纖毛細胞和杯狀細胞組成的纖毛上皮完整覆蓋于氣管內(nèi)表面，且未見脫落、缺失等病變。上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，黏膜及黏膜下層未見出血、炎性細胞浸潤。氣管環(huán)正常，且未見斷裂、缺損等病變，外膜完整。ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，ALG-NPs各劑量組小鼠氣管病理切片顯微照片與對正常照組小鼠基本一致，未見明顯異常改變。

圖6 小鼠氣管顯微病理照片（×200，標(biāo)尺：200 μm）Fig.6 Micropathological photos of the trachea in mice（×200，scale bar：200 μm）

3.8 肺系數(shù) 急性肺損傷重要的病理標(biāo)志為肺微血管通透性增加，當(dāng)肺內(nèi)液體滲出和吸收的平衡遭到破壞時，常表現(xiàn)為富含炎性介質(zhì)的液體滲入組織間隙，從而引起肺水腫[17]。肺系數(shù)可反映肺水腫、肺纖維化以及肺部感染等情況。因此，測定各組小鼠肺系數(shù)考察研究超聲霧化吸入ALG-NPs對小鼠肺組織的影響。肺系數(shù)結(jié)果如圖7所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，與空白對照組相比較，ALG-NPs各劑量組小鼠肺系數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示在本實驗中超聲霧化吸入ALG-NPs對小鼠肺組織損傷較小。

圖7 各組小鼠肺系數(shù)（n=6）Fig.7 Lung index in each group（n=6）

3.9 血清及肺組織中IL-6、TNF-α含量測定 如圖8所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d后，與空白對照組比較，ALG-NPs各劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ALGNPs經(jīng)超聲霧化吸入14 d后，與空白對照組比較，ALG-NPs高劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01），提示有炎癥發(fā)生，與肺組織病理解剖觀察結(jié)果一致。ALG-NPs低及中劑量組血清及肺組織勻漿中IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。如圖9所示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入7 d或14 d后，與空白對照組比較，ALG-NPs各劑量組血清及肺組織勻漿中TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討論

納米凝膠作為一種新型的給藥系統(tǒng)，能借助納米粒的特殊性質(zhì)顯著提高難溶性藥物的溶解度和穩(wěn)定性，并具有緩釋和靶向的特點，是靶向給藥的理想載體[18]。海藻酸鈉是由直鏈鍵合的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）組成的無規(guī)嵌段共聚物，是一種低毒、可生物降解、生物相容性好的常用制藥輔料。其中，在藥物/蛋白質(zhì)輸送載體的研究中，海藻酸鈣凝膠珠或微球已經(jīng)得到了較高的關(guān)注[19-20]。本研究構(gòu)建了ALG-NPs，以期作為藥物的緩釋載體通過超聲霧化吸入靶向輸送至肺，為治療呼吸系統(tǒng)疾病提供參考。

圖8 ALG-NPs對小鼠血清（A）及肺組織（B）中IL-6水平的影響（n=6）Fig.8 Effects of ALG-NPs on IL-6 levels in the serum and the lung tissue of mice（n=6）

圖9 ALG-NPs對小鼠血清（A）及肺組織（B）中TNF-α水平的影響（n=6）Fig.9 Effects of ALG-NPs on TNF-α levels in the serum and the lung tissue of mice（n=6）

超聲霧化吸入是利用超聲波產(chǎn)生的能量，使藥液于氣相中分散，形成直徑<5 μm的霧滴，隨著自主呼吸使藥物直接作用于咽喉、氣管、支氣管及肺泡等部位[21]。由于肺部具有特有的生理解剖特點，如肺泡表面積巨大（大約100 m2）、毛細血管網(wǎng)豐富、肺泡上皮細胞膜較薄、氣血通路狹小等[22]，與其他給藥途徑相比，霧化吸入具有局部藥物濃度高、起效迅速、操作簡便及不良反應(yīng)少等優(yōu)勢，符合臨床給藥需求，提高了患者的順應(yīng)性，利于臨床的普及與推廣[8]。

藥物超聲霧化吸入對機體的不良反應(yīng)通常是對呼吸道和肺部的刺激，TNF-α是炎癥及應(yīng)激反應(yīng)過程中最早出現(xiàn)且最重要的炎性介質(zhì)之一，同時也是急性肺損傷發(fā)病的啟動因子，多種原因?qū)е碌臋C體炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài)均會伴隨TNF-α的生成和釋放[23]。當(dāng)炎癥及應(yīng)激反應(yīng)等原因刺激機體時，TNF-α可啟動炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)單核巨噬細胞、淋巴細胞刺激機體生成和分泌IL-6[24]，在血清和局部組織中會出現(xiàn)高表達，IL-6作為重要的炎性介質(zhì)，與組織的損傷程度成正相關(guān)[25]。機體長期（14 d）超聲霧化吸入大劑量外源性藥物ALG-NPs后，會引起機體血清及局部肺組織勻漿中IL-6水平增高，ALG-NPs高劑量組較為顯著，ALG-NPs低、中劑量霧化時對機體刺激性不大。當(dāng)機體隨著刺激頻次的增加，機體耐受程度逐漸提高，機體對TNF-α的免疫應(yīng)答水平逐漸降低，這與文獻報道的結(jié)果相一致[26]。

以上結(jié)果提示，ALG-NPs經(jīng)超聲霧化吸入后，對小鼠肺組織及氣道無明顯損傷即局部刺激性較小，且于安全劑量范圍內(nèi)（≤150 mg/kg）無任何炎癥反應(yīng)，對于納米凝膠制劑的基礎(chǔ)研究和臨床推廣具有一定的參考價值。