miR-381通過下調(diào)SETDB1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

滿艷 褚靜

(1棗莊學(xué)院校醫(yī)院消化科，山東 棗莊 277160；2棗莊市中醫(yī)醫(yī)院消化科)

結(jié)腸癌是我國近年來發(fā)病率升高較快的消化系統(tǒng)腫瘤之一〔1〕。結(jié)腸癌患者早期多以納差、體重減輕及排便習(xí)慣改變等亞臨床表現(xiàn)為主，大多數(shù)患者就診時(shí)已處于疾病中后期而喪失了獲得良好預(yù)后的機(jī)會(huì)〔2〕。因而研究結(jié)腸癌新的診斷標(biāo)志物及分子治療策略對(duì)提高結(jié)腸癌患者手術(shù)切除率及改善患者長期預(yù)后具有重要作用。

微小RNA(miRNA)是一類長度在25個(gè)堿基以內(nèi)的單鏈RNA〔3〕。在結(jié)腸癌中已發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞增殖〔4〕、轉(zhuǎn)移〔5〕及血管生成〔6〕密切相關(guān)的miRNA。miR-381是近年來新鑒定的出的一種miRNA，它在胃癌〔7〕、肝癌〔8〕及乳腺癌〔9〕中的表達(dá)水平顯著下調(diào)并能抑制腫瘤細(xì)胞生長及侵襲，提示miR-381是一種潛在的抑癌基因。目前，miR-381在結(jié)腸癌中的表達(dá)變化、臨床意義及生物學(xué)功能均尚不完全清楚。本研究通過檢測(cè)miR-381在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況；利用人工合成的miR-381模擬物特異性上調(diào)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中miR-381的表達(dá)水平，探究上調(diào)miR-381基因表達(dá)在體外對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。旨在為miR-381成為抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子治療靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1組織標(biāo)本 選取2013年1月至2016年10月于棗莊市中醫(yī)醫(yī)院消化科收治并行手術(shù)切除的50例結(jié)腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣距離>2 cm)標(biāo)本。所有標(biāo)本于離體半小時(shí)內(nèi)取材，分兩份于4%多聚甲醛及液氮中固定保存。

1.2細(xì)胞來源及主要試劑 SW480細(xì)胞由消化科實(shí)驗(yàn)室保存；miR-381模擬物(mimics)、陰性對(duì)照模擬物 (control mimics)、miR-381莖環(huán)引物試劑盒(含內(nèi)參RNU6B)均購自廣州銳博基因公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Trizol RNA提取試劑、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、RT-PCR試劑盒及qPCR試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國康寧公司；基質(zhì)膠購自美國B&D公司；免疫組化Sp法試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司。組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域分支型(SETDB)1及GAPDH抗體由Santa Cruz公司提供。SETDB1引物(上游5′-GGGCAAGGGTGTTTTCATTAAC-3′；下游5′-GTTAGTTGATGGCAGGCACACTT-3′)及GAPDH引物(上游5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′；下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′)由上海生工生物有限公司合成。

1.3qRT-PCR 通過Trizol試劑提取標(biāo)本及細(xì)胞RNA，配制逆轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增體系。設(shè)置反轉(zhuǎn)錄條件：50℃ 30 min，94℃ 2 min，循環(huán)次數(shù)1；94℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 3 min，循環(huán)次數(shù)40；72℃ 10 min。通過2-△△Ct法檢測(cè)miR-381及SETDB1 mRNA的相對(duì)含量。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 SW480細(xì)胞于適宜環(huán)境中培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代2～3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SW480細(xì)胞按過夜增殖至愈合度達(dá)70%的密度接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。達(dá)到預(yù)定培養(yǎng)密度后移除培養(yǎng)基，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液充分洗滌細(xì)胞。轉(zhuǎn)染分組：miR-381組每孔加入100 pmol miR-381 mimics、5 μl Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑及2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基；miR-control組每孔加入100 pmol control mimics、5 μl Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑及2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5劃痕愈合試驗(yàn) SW480細(xì)胞接種于6孔板中，接種密度以過夜鋪滿為準(zhǔn)。無血清DMEM培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h以削弱細(xì)胞黏附作用。100 μl的移液器槍頭由每孔中線劃過，PBS清洗6孔板內(nèi)殘余懸浮細(xì)胞，每孔加入2 ml無血清DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.6Transwell侵襲小室 用1×DMEM按8∶1稀釋50 mg/L的基質(zhì)膠，按100 μl每孔包被Transwell小室底膜上室面，4℃風(fēng)干后放入24孔板內(nèi)。收集轉(zhuǎn)染后的SW480細(xì)胞，以無血清DMEM培養(yǎng)基重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，按250 μl每孔接種于Transwell小室上室中，24孔板內(nèi)每孔加入750 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后棄去上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細(xì)胞，在200倍顯微鏡下觀察下室面細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.7Western印跡法 RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜后用5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h；用3%濃度的脫脂奶粉溶液按1∶1 000比例稀釋的SETDB1及GAPDH抗體。在4℃下孵育相應(yīng)條帶過夜。洗去殘余一抗后采用1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育條帶1 h。于暗室內(nèi)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)法觀察蛋白表達(dá)。

1.8免疫組化 多聚甲醛固定、石蠟包埋的結(jié)腸癌及癌旁標(biāo)本組織切片常規(guī)進(jìn)行脫蠟及水化預(yù)處理；用抗體稀釋液按1∶100比例稀釋兔抗人SETDB1多克隆抗體，滴加抗體于組織切片上并充分浸沒組織標(biāo)本；4℃恒溫冰箱內(nèi)孵育過夜，洗凈未結(jié)合一抗后，使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗結(jié)合相應(yīng)一抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法顯示陽性蛋白。400倍視野下每張組織切片下隨機(jī)選取10個(gè)視野按文獻(xiàn)〔10〕所述方法進(jìn)行免疫組化評(píng)分。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行χ2檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-381在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及臨床意義 50例結(jié)腸癌組織中miR-381的表達(dá)水平(0.627±0.054)顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織(1.361±0.048)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.080，P<0.001)。通過分析50例結(jié)腸癌患者的臨床病理特征表明，具有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者的miR-381表達(dá)量(0.457±0.052)比無轉(zhuǎn)移患者(0.750±0.079)更低(t=2.855，P=0.006)。提示miR-381對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有一定調(diào)節(jié)作用。

2.2miR-381抑制SW480細(xì)胞遷移及侵襲 PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-381 mimics的細(xì)胞內(nèi)miR-381表達(dá)水平較miR-control組顯著升高(45.378±3.087 vs 1.000±0.000，t=16.564，P<0.001)。劃痕愈合試驗(yàn)結(jié)果表明，與miR-control組比較，miR-381組顯著降低了SW480細(xì)胞的遷移能力(73.842±6.793 vs 19.840±5.550，t=4.223，P=0.027)，見圖1；transwell侵襲小室模型檢測(cè)結(jié)果表明，miR-381組(11.702±4.327)顯著少于miR-control組侵襲細(xì)胞數(shù)目(33.103±5.292)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.651，P=0.033)，見圖2。

2.3miR-381抑制SW480細(xì)胞中SETDB1的表達(dá) 為研究miR-381在結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用機(jī)制，本研究通過生物信息學(xué)檢索發(fā)現(xiàn)SETDB1可能是miR-381的潛在作用靶點(diǎn)之一。見圖3。為驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究通過qPCR和蛋白免疫印跡檢測(cè)了過表達(dá)miR-381后SW480細(xì)胞內(nèi)SETDB1表達(dá)的變化。結(jié)果表明，與miR-Control組相比，miR-381組SW480細(xì)胞內(nèi)SETDB1 mRNA(1.000±0.000 vs 0.408±0.082，t=10.521，P=0.008)及蛋白(0.881±0.137 vs 0.315±0.056，t=4.786，P=0.027)水平均顯著降低。SETDB1下游靶基因基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2蛋白的表達(dá)也明顯下調(diào)(0.331±0.034 vs 0.114±0.021，t=3.472，P=0.036)。見圖4、圖5。

2.4SETDB1在肝癌中的表達(dá)及與miR-381的表達(dá)相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中SETDB1的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高(9.064±1.045 vs 3.117±0.521，t=5.272，P=0.011)；Pearson相關(guān)性分析表明SETDB1與miR-381的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.325，P=0.021)。進(jìn)一步證明了miR-381對(duì)SETDB1的調(diào)控作用。見圖6、圖7。

圖1 兩組不同時(shí)間SW480細(xì)胞遷移能力比較(×200)

圖2 兩組SW480細(xì)胞侵襲數(shù)目比較(×200)

圖3 miR-381與靶基因SETDB1的互補(bǔ)關(guān)系

圖4 Western印跡檢測(cè)SETDB1蛋白表達(dá)

圖5 Western印跡檢測(cè)MMP-2蛋白表達(dá)

圖6 SETDB1與miR-381的相關(guān)性

圖7 結(jié)腸癌組織與癌旁組織SETDB1表達(dá)(×400)

3 討 論

miR-381在不同類型的惡性腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)并不統(tǒng)一〔11〕。本研究通過qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-381在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平要低于癌旁組織，說明在miR-381在結(jié)腸癌中可能是一種抑癌因子。同時(shí)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中miR-381的表達(dá)量要更低，因此miR-381可能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究設(shè)計(jì)了一系列體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-381在體外培養(yǎng)環(huán)境中均具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。有研究也指出，miR-381也能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡而降低腫瘤的生長能力〔12〕。說明miR-381的抗腫瘤效應(yīng)具有生物多樣性，值得今后的工作中進(jìn)一步深入研究。

miRNA能夠通過結(jié)合靶基因3′-UTR區(qū)而發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。通過生物信息學(xué)檢索分析發(fā)現(xiàn)，SETDB1 mRNA存在miR-381的結(jié)合位點(diǎn)。既往研究〔13〕也表明SETDB1在結(jié)腸癌內(nèi)高表達(dá)且具有促癌作用，其可能是miR-381的潛在靶點(diǎn)之一。通過PCR及蛋白印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-381在體外的確能下調(diào)SETDB1的表達(dá)水平。在多種疾病模型中的研究結(jié)果表明SETDB1能夠調(diào)節(jié)包括Wnt/β-catenin在內(nèi)的多條信號(hào)通路而影響細(xì)胞的生物學(xué)特性〔14〕。研究表明，與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的MMP-2也是SETDB1的下游效應(yīng)分子之一〔15〕。本研究中，過表達(dá)miR-381后，在下調(diào)SETDB1表達(dá)水平的同時(shí)MMP-2的表達(dá)水平也受到抑制，提示miR-381的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用最終可能是通過下調(diào)MMP-2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，miR-381在結(jié)腸癌中低表達(dá)，上調(diào)miR-381可能通過抑制SETDB1/MMP-2的表達(dá)而抑制結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。