鱘形目魚類染色體研究現(xiàn)狀及進(jìn)展

曾慶凱，杜合軍，楊 菁

( 1.三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443100；2.中國長江三峽集團(tuán)有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100 )

染色質(zhì)是真核生物遺傳物質(zhì)的載體，在細(xì)胞分裂過程中，核內(nèi)染色質(zhì)凝縮呈線狀，對堿性染料較為敏感，此時(shí)稱其為染色體[1]。對染色體玻片標(biāo)本和染色體照片進(jìn)行對比分析，并根據(jù)各染色體的長度、著絲點(diǎn)位置、臂比、隨體有無等形態(tài)特征進(jìn)行觀測、描述和分組，確定其染色體組型，是染色體研究的基本方式。此外，通過不同的顯帶方式對染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行對比分析，也是常用的染色體研究方法。染色體研究有助于探明生物遺傳組成、遺傳變異規(guī)律和發(fā)育機(jī)制，染色體研究結(jié)果對真核生物雜交育種、多倍體育種、性別遺傳機(jī)理、基因組數(shù)、物種起源與進(jìn)化和種族關(guān)系鑒定等具有一定的參考價(jià)值[2]。

鱘形目魚類，隸屬于硬骨魚綱、輻鰭亞綱、軟骨硬鱗下綱，是一個(gè)古老的生物類群，在距今2億年的白堊紀(jì)晚期，它們便生活在地球上，在脊椎動(dòng)物遺傳與進(jìn)化學(xué)研究中具有重要價(jià)值[3]。鱘形目魚類現(xiàn)存2科6屬27種，全部分布于北半球的大型河流，咸、淡水湖泊及海水水域[4]。近年來，受到過度捕撈、偷獵、洄游受阻、產(chǎn)卵棲息地喪失、水質(zhì)惡化、餌料匱乏等方面的影響，野生鱘形目中很多種類正瀕臨滅絕[5-6]。27種鱘魚中有18種被認(rèn)為是極度瀕危物種，2種為瀕危物種，3種為易危物種，其他為近危物種或無危物種，其中野生白鱘(Psephurusgladius)自2003年之后再未見報(bào)道[7]。因此，針對鱘形目魚類開展各項(xiàng)保護(hù)和研究工作變得極為迫切。筆者主要針對鱘魚染色體的研究概況進(jìn)行介紹，以期對鱘魚保護(hù)和研究工作起到一定的積極作用。

1 鱘魚染色體標(biāo)本制備及其染色體數(shù)目

隨著細(xì)胞低滲處理技術(shù)和氣干法在染色體制備中得到應(yīng)用，中期分裂相細(xì)胞的獲取成為了染色體標(biāo)本制備的關(guān)鍵[8]。根據(jù)細(xì)胞獲取方法的不同，染色體標(biāo)本制備的方法主要有活體注射法、細(xì)胞培養(yǎng)法、胚胎細(xì)胞直接制片法、幼魚游泳法等[9-12]。

鱘魚中也有利用活體注射法制作染色體標(biāo)本的報(bào)道，如短吻鱘(Acipenserbrevirostrum)[13]、施氏鱘(A.schrenckii)[14]、小體鱘(A.ruthenus)[15]、匙吻鱘(Polyodonspathula)[16]、阿姆河大擬鏟鱘(Pseudoscaphirhynchuskaufmanni)[17]等。還有早年中華鱘(A.sinensis)核型分析也是采用腎細(xì)胞培養(yǎng)的方法完成的[18]。鱘魚作為大型魚類，解剖工作需要耗費(fèi)大量人力物力，而作為珍稀魚類，應(yīng)避免減少其種群數(shù)目?；铙w注射法和內(nèi)臟器官細(xì)胞培養(yǎng)法均需對研究對象進(jìn)行解剖，目前在鱘魚染色體標(biāo)本制備中已經(jīng)極少采用。鰭條、皮膚、外周血等組織樣本的采集對魚體的傷害較小，因此使用這些組織樣本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)制備染色體是比較適合的方式，現(xiàn)今常用的鱘魚染色體制備方法有鰭條細(xì)胞系培養(yǎng)法、外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法等。

Fontana等[19]研究了達(dá)氏鰉(Husodauricus)、高首鱘(A.transmontanus)和西伯利亞鱘(A.baerii)鰭條成纖維細(xì)胞系的培養(yǎng)，獲得這3種鱘魚的鰭條成纖維細(xì)胞系。利用這些細(xì)胞系的制作染色體標(biāo)本，均獲得了清晰的染色體標(biāo)本，分析得出西伯利亞鱘的核型為2n=246±10，達(dá)氏鰉的核型為2n=120±8，高首鱘為2n=246±10，該結(jié)果與已有的報(bào)道無顯著性差異[20]。在此基礎(chǔ)上，研究人員對小體鱘[21]、納氏鱘(A.naccarii)[21]、歐洲大西洋鱘(A.sturio)[22]和湖鱘(A.fulvescens)[23]等進(jìn)行了一系列的染色體相關(guān)研究，解析其進(jìn)化關(guān)系、倍型等科學(xué)問題，以促進(jìn)鱘魚細(xì)胞遺傳學(xué)的研究。

外周血淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，不同魚類的外周血淋巴細(xì)胞對于培養(yǎng)條件的要求差異較大；同種魚類隨著季節(jié)、年齡、性成熟以及生理?xiàng)l件的不同，其淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)差異巨大。Fujiwara等[24]探討了不同培養(yǎng)基以及不同促淋巴細(xì)胞分裂劑對淋巴細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的效應(yīng)情況，應(yīng)用于高首鱘染色體標(biāo)本制備中，并獲得較好的結(jié)果。Symonová等[25]在該方法基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，制作并獲得了分散良好的雜交鱘的染色體標(biāo)本。Nowruzfashkhami等[26]采用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法制作了波斯鱘(A.persicus)的染色體，分析得出其核型為2n=258±4。董穎等[27]以小體鱘為研究對象，對其外周血淋巴細(xì)胞體外增殖的培養(yǎng)條件也進(jìn)行了探討，為鱘魚染色體標(biāo)本制備提供技術(shù)參考。相對鰭條細(xì)胞培養(yǎng)而言，外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢在于花費(fèi)的時(shí)間更短。

鱘形目魚類是一種多倍體起源的魚類，細(xì)胞水平的進(jìn)化有別于其他魚類，其染色體數(shù)目眾多，形態(tài)多樣。根據(jù)染色體數(shù)目可將鱘形目魚類分為3類：染色體數(shù)目為110～130的A類，染色體數(shù)目為220～276的B類以及染色體數(shù)目約372的C類[28-29]。其染色體形態(tài)多樣，包含了中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體以及點(diǎn)狀的微染色體等類型，并且不同類型染色體存在較為明顯的大小差異[30-31]。

開展鱘魚染色體研究不僅對于鱘魚分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生研究有十分重要的意義，而且對于現(xiàn)代分子生物學(xué)中的基因定位、原位雜交、種間雜交鑒定和倍型研究等方面也有實(shí)際意義[32-33]。然而，由于鱘魚染色體數(shù)目多，存在大量的微染色體，目前的研究大都只能給出染色體數(shù)目的大概范圍，這使染色體研究面臨極大挑戰(zhàn)，也使鱘魚細(xì)胞遺傳學(xué)研究難以深入[34]。已報(bào)道的部分鱘魚染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)情況見表1。

2 鱘形目魚類染色體顯帶研究

染色體研究除了對其數(shù)目進(jìn)行研究之外，還可通過不同的顯帶方式對其帶型進(jìn)行分析。高分辨率顯帶技術(shù)能顯示染色體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，提供更多具有鑒定性特征的信息，即顯示染色體的“解剖學(xué)”特征，它被廣泛應(yīng)用于動(dòng)、植物和人類的染色體研究領(lǐng)域。該方法不僅能指導(dǎo)同源染色體的配對和核型排列，而且能顯示染色體的結(jié)構(gòu)與變化。如染色體的易位、缺失、重復(fù)、臂間和臂內(nèi)倒位，能正確地識別特定染色體，已成為鑒定單個(gè)染色體和染色體組、探討物種染色體進(jìn)化和系統(tǒng)分類等問題的方法和手段之一[32]。

表1 部分鱘形目魚類染色體數(shù)目

根據(jù)染料及染色方法的不同，染色體顯帶技術(shù)包括C顯帶技術(shù)、Q顯帶技術(shù)、G顯帶技術(shù)、R顯帶技術(shù)和銀染顯帶技術(shù)等。除此之外，熒光染料色霉素A3(CMA3)和4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)也被用于魚類染色體顯帶技術(shù)，前者為GC特異性染料，后者為AT特異性染料[52]。運(yùn)用不同的顯帶方式，鱘形目魚類染色體研究主要包括異染色質(zhì)區(qū)、核仁組織區(qū)、AT豐富區(qū)以及GC豐富區(qū)等方面。

2.1 鱘形目魚類染色體異染色質(zhì)研究

染色體異染色質(zhì)主要采用C顯帶技術(shù)進(jìn)行研究[53]。鱘形目魚類中的西伯利亞鱘[33]、閃光鱘[38]、高首鱘[48]、俄羅斯鱘[50]、歐洲鰉[54]、小體鱘[55]等的C顯帶研究均有報(bào)道。從各鱘魚的C顯帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即使是最小的微染色體，C顯帶也可以將常染色質(zhì)區(qū)和異染色質(zhì)區(qū)清晰地區(qū)分開，反之也證明這些微染色體的確屬于染色體，而非雜質(zhì)[33]。此外，鱘魚的C帶一般只在中型染色體、小型染色體以及微染色體上出現(xiàn)，大型染色體上幾乎未見C帶，只有閃光鱘例外，其大型染色體上可檢測出清晰的C帶，并且出現(xiàn)在其短臂上，而非通常的著絲粒區(qū)域[38]。另外俄羅斯鱘的C帶符合鱘魚C帶染色也表現(xiàn)了其特異性，即其中4個(gè)中型染色體被完全侵染，表現(xiàn)出完全異質(zhì)性[50]。根據(jù)目前有關(guān)鱘魚染色體異染色質(zhì)的分析報(bào)道，有研究人員認(rèn)為鱘魚染色體核型進(jìn)化過程符合羅伯遜融合假設(shè)，即當(dāng)兩條近著絲粒染色體在著絲?；蚱涓浇骋徊课话l(fā)生斷裂后，二者的長臂構(gòu)成一個(gè)大的染色體，而其短臂構(gòu)成一個(gè)小的染色體[28,56]。關(guān)于該論斷的正確性有待進(jìn)一步研究論證。

2.2 鱘形目魚類染色體核仁組織區(qū)研究

核仁組織區(qū)是指核糖體基因在染色體上的分布區(qū)域，利用銀染技術(shù)可以使核仁組織區(qū)特異性著色，從而分析染色體上核仁組織區(qū)的特點(diǎn)[57]。Fontana[3]使用銀染技術(shù)比較了西伯利亞鱘、納氏鱘、高首鱘和小體鱘的核仁組織區(qū)，發(fā)現(xiàn)小體鱘的核仁組織區(qū)分布在兩對形態(tài)不同的同源染色體上，而其他3種鱘魚的核仁組織區(qū)分布在兩組四聯(lián)體上，根據(jù)同源染色體配對原則，推斷小體鱘為二倍體，其他3種鱘為四倍體。短吻鱘染色體銀染顯帶發(fā)現(xiàn)10個(gè)核仁組織區(qū)，被認(rèn)為是六倍體物種[13]。從以上結(jié)果推斷，鱘魚的倍型或許可界定為：A類為二倍體，B類為四倍體，C類為六倍體。推斷結(jié)果的準(zhǔn)確性還需要更多研究的支持。

有研究認(rèn)為核仁組織區(qū)數(shù)目的多少可反映物種的進(jìn)化程度，核仁組織區(qū)越少，其進(jìn)化程度越低，更有可能為相對原始的物種[58]?；诖擞^點(diǎn)，研究人員推測含有3對核仁組織區(qū)的歐洲大西洋鱘(2n=120)相對于含有2個(gè)核仁組織區(qū)的小體鱘(2n=120)和歐洲鰉(2n=120)為較新的物種[22]。在俄羅斯鱘的染色體帶型研究中，有14個(gè)核仁組織區(qū)被發(fā)現(xiàn)，其中4個(gè)中型染色體的核仁組織區(qū)分布在其雙臂的端粒上，一個(gè)中著絲粒染色體的核仁組織區(qū)分布在長臂端粒上，4個(gè)雙臂染色體和4個(gè)端著絲粒染色體的核仁組織區(qū)分布在短臂端粒上，另外還有1個(gè)大型中著絲粒染色體的核仁組織區(qū)也分布在短臂端粒上，推測俄羅斯鱘的染色體在進(jìn)化過程中發(fā)生了易位重排的現(xiàn)象，進(jìn)一步支持了鱘魚進(jìn)化的羅伯遜融合假設(shè)[50]。

2.3 鱘形目魚類染色體GC和AT豐富區(qū)研究

CMA3和DAPI均為能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用于熒光顯微鏡觀測。CMA3和DAPI分別為GC特異性染料和AT特異性染料。目前，已有多種鱘魚采用這兩種染料進(jìn)行了染色體研究，比如納氏鱘[3]、湖鱘[23]、俄羅斯鱘[50]、歐洲鰉[54]等。DAPI的染色結(jié)果顯示，各種類染色體不存在特異性，而CMA3在不同染色體上表現(xiàn)出了不同的染色效果。在俄羅斯鱘中，大多數(shù)小型染色體的端粒區(qū)域以及亞中著絲粒染色體和中著絲粒染色體的著絲?；蛘叨肆^(qū)域均能檢測到熒光信號；其中4個(gè)中型的中著絲粒染色體被完全染色[50]。在歐洲鰉中，大多數(shù)小型染色體都顯現(xiàn)CMA3陽性帶，大型染色體中部分近端著絲粒染色體的CMA3陽性帶在近端著絲粒區(qū)域，另外還有少部分亞中著絲粒和中著絲粒的其中兩條臂上也有陽性帶[54]。在納氏鱘的染色體研究中，使用CMA3對其染色體進(jìn)行染色，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其中一條中等大小的染色體整體都被染色，而多數(shù)小型染色體上僅部分被染色[3]。此外，CMA3還常被用于核仁組織區(qū)的研究，但是在鱘魚的研究中發(fā)現(xiàn)，GC豐富區(qū)與鱘魚核仁組織區(qū)之間似乎沒有絕對的聯(lián)系，因此鱘魚中很少采用該染料研究核仁組織區(qū)[23,50]。

3 鱘形目魚類的熒光原位雜交顯帶研究

熒光原位雜交技術(shù)是指細(xì)胞學(xué)方法與分子雜交技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是利用熒光標(biāo)記的核酸片段為探針，與中期細(xì)胞的染色體或間期細(xì)胞核的DNA雜交，在染色體上或核中顯示與探針同源的DNA片段的位置，從而將這段DNA序列定位在細(xì)胞中[59]。此技術(shù)應(yīng)用在染色體鑒定、異常染色體檢測、某些特殊染色體在核中的位置及基因定位等研究領(lǐng)域。由于這項(xiàng)技術(shù)定位準(zhǔn)確，應(yīng)用越來越廣泛，在鱘魚染色體研究中也得到廣泛應(yīng)用。應(yīng)用于鱘魚熒光原位雜交技術(shù)的探針主要有：端粒、核糖體DNA (rDNA)、Hind Ⅲ衛(wèi)星DNA家族等。

3.1 鱘形目魚類端粒研究

端粒是指染色體末端所特有的帽子片段，重復(fù)序列(TTAGGG)n在所有的脊椎動(dòng)物中高度保守，所有脊椎動(dòng)物染色體的端粒位置都具有重復(fù)序列(TTAGGG)n[60]。通常情況下，正常的染色體均有端粒序列。歐洲大西洋鱘[22]、湖鱘[23]、小體鱘[36]、西伯利亞鱘[36]、納氏鱘[36]、俄羅斯鱘[36]、閃光鱘[38]以及歐洲鰉[54]的染色體端粒序列研究中，所有染色體都能檢測到端粒序列的熒光信號，此結(jié)果進(jìn)一步說明，即使是個(gè)體極其微小的微染色體，也具有完整的染色體結(jié)構(gòu)。端粒序列一般位于染色體的體臂末端，但一些特殊的物種在染色體的常染色質(zhì)或異染色質(zhì)中也發(fā)現(xiàn)端粒信號，如湖鱘[23]和俄羅斯鱘[36]都有兩條染色體被端粒熒光信號完全覆蓋。以下兩種推斷可解釋該現(xiàn)象：其一，認(rèn)為這兩種鱘魚極有可能發(fā)生了染色體重排，它們可能由其他鱘魚進(jìn)化而來；其二，這兩種鱘魚在染色體間質(zhì)區(qū)域存在與端粒序列類似的重復(fù)序列，從而導(dǎo)致被端粒信號完全覆蓋。

3.2 鱘形目魚類核糖體DNA(rDNA)研究

真核生物的rDNA由兩個(gè)高度重復(fù)的基因家族構(gòu)成，分別是主rDNA基因簇(18S、5.8S和28S rDNAs)和次rDNA基因簇(5S rDNA)[33]。其中核仁組織區(qū)即為主rDNA基因簇區(qū)域，在鱘魚染色體研究中，該區(qū)域常采用銀染或rDNA探針來檢測。研究發(fā)現(xiàn)，采用rDNA探針檢測到的核仁組織區(qū)往往比銀染方法要多。如歐洲鰉[54]中，通過銀染發(fā)現(xiàn)兩對中型染色體上具有核仁組織區(qū)，而28S rDNA探針檢測發(fā)現(xiàn)6條染色體具有核仁組織區(qū)信號；歐洲大西洋鱘[22]的研究結(jié)果與其類似。根據(jù)此結(jié)果推斷，銀染只能使具有活性的核仁組織區(qū)顯色，而28S rDNA不僅能檢測銀染能檢測的活性區(qū)域，還能檢測銀染檢測不到的非活性核仁組織區(qū)[21,33]。因此，使用rDNA探針研究核仁組織區(qū)相比銀染能獲得更全面更精確的定位結(jié)果。

rDNA在鱘魚進(jìn)化關(guān)系和染色體倍型研究中得到應(yīng)用。小體鱘[21]、歐洲大西洋鱘[33]、歐洲鰉[54]這3種A類鱘魚的5S rDNA信號為2，納氏鱘[21]、俄羅斯鱘[33]這兩種B類鱘魚的5S rDNA信號為4。根據(jù)同源染色體配對的原則，從5S rDNA信號的數(shù)目推斷A類鱘魚屬于二倍體，B類為四倍體。研究發(fā)現(xiàn)，短吻鱘5S rDNA的370余條染色體中出現(xiàn)了6個(gè)信號，研究人員認(rèn)為其為6倍體，并推斷短吻鱘可能是由A類鱘魚和B類鱘魚雜交出現(xiàn)的新種[51]。

3.3 鱘形目魚類Hind Ⅲ衛(wèi)星DNA家族研究

HindⅢ衛(wèi)星DNA家族是串聯(lián)重復(fù)的非編碼DNA序列，其主要分布在染色體的異染色質(zhì)區(qū)域，比如著絲粒和端粒區(qū)域[62]。有證據(jù)表明衛(wèi)星DNA 與基因組的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性相關(guān)，其在進(jìn)化過程中具有較高的突變率，是研究物種分類和進(jìn)化關(guān)系的重要工具[63-66]。

鱘魚相關(guān)研究中，納氏鱘[67]中首先分離得到了Hind Ⅲ衛(wèi)星DNA家族，并以此設(shè)計(jì)熒光原位雜交探針對閃光鱘[38]、西伯利亞鱘、俄羅斯鱘、納氏鱘、小體鱘、歐洲大西洋鱘、高首鱘和歐洲鰉[68]的衛(wèi)星DNA進(jìn)行了研究，結(jié)果除了歐洲大西洋鱘外，其他鱘魚都有清晰可見的熒光信號。推斷歐洲大西洋鱘極有可能是由其他鱘魚進(jìn)化產(chǎn)生的物種[69-70]。

4 存在問題與展望

鱘形目魚類染色體數(shù)量多，形態(tài)復(fù)雜，現(xiàn)今的染色體制備方法仍舊無法滿足鱘魚細(xì)胞遺傳學(xué)的更深入研究。比如，達(dá)氏鰉的染色體數(shù)目研究存在較大的爭議，早期的達(dá)氏鰉核型研究中發(fā)現(xiàn)其有120條染色體，而Vasil′ev等[44]研究結(jié)果表明，其染色體數(shù)目為268±4，但是DNA含量測定結(jié)果又更加支持達(dá)氏鰉染色體為120條的結(jié)果。在無法準(zhǔn)確鑒定出染色體數(shù)目的情況下，繼續(xù)深入開展細(xì)胞遺傳學(xué)研究，難以評估研究結(jié)果的有效性，因此鱘形目魚類染色體標(biāo)本制備方法的研究仍舊是一個(gè)難題。

匙吻鱘鰭條細(xì)胞系建立的研究中，研究人員對第9代和第59代傳代細(xì)胞進(jìn)行了染色體分析，顯示第9代的染色體數(shù)為2n=120，而第59代的為2n=90，說明染色體在細(xì)胞培養(yǎng)至59代出現(xiàn)了大量丟失[71]。研究人員分析了中華鱘第21代傳代細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)71%的細(xì)胞染色體數(shù)目均低于264，說明傳至21代大部分細(xì)胞的染色體出現(xiàn)丟失[47]。細(xì)胞系的建立在珍稀瀕危物種的保護(hù)中具有重要意義，動(dòng)物細(xì)胞系在傳代過程中染色體數(shù)目會(huì)發(fā)生變化，因此染色體組型的研究對細(xì)胞培養(yǎng)過程中遺傳變異的檢測具有重要作用[72]。大部分鱘魚都處于瀕危狀態(tài)，進(jìn)一步開展染色體研究工作，對這些鱘魚在細(xì)胞水平的保護(hù)具有重要意義。

我國境內(nèi)已知有8種鱘魚，包括達(dá)氏鰉、施氏鱘、西伯利亞鱘、小體鱘、裸腹鱘、中華鱘、達(dá)氏鱘和白鱘[73]。關(guān)于西伯利亞鱘、小體鱘、裸腹鱘的染色體研究已有較多的報(bào)道，而其他幾種鱘魚的染色體研究尚比較缺乏，為了更深入認(rèn)識鱘形目魚類的進(jìn)化關(guān)系及其在脊椎動(dòng)物進(jìn)化中的地位，進(jìn)一步開展其他幾種瀕危鱘魚的染色體研究是有必要的。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)人工養(yǎng)殖的庫頁島鱘[43]和西伯利亞鱘[74]存在自發(fā)多倍體化的現(xiàn)象。目前對瀕危鱘魚的野生種群的補(bǔ)充大都采用人工養(yǎng)殖放流的方式，有必要對放流群體進(jìn)行種質(zhì)鑒定，以避免對野生種群的遺傳結(jié)構(gòu)造成不良的影響。