果寡糖對斜帶石斑魚免疫功能和腸道形態(tài)的影響

胡凌豪，楊紅玲，2，趙 蕓，葉繼丹，2，魯康樂，2，孫云章，2，3

( 1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021；3.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建 廈門 361021 )

果寡糖又稱低聚果糖，是一種由果糖單體在蔗糖上以β-1,2糖苷鍵連接而成的碳水化合物[3]。果寡糖能順利通過胃和小腸而不被降解，同時能被乳酸菌、芽孢桿菌(Bacillus)等有益菌利用，從而使得有益菌得到養(yǎng)分后增殖，改善腸道微生態(tài)系統(tǒng)[4]。此外，果寡糖吸濕性低，防霉性能好，還能減少飼料發(fā)霉、變質(zhì)，延長飼料貯存期[5]。果寡糖的效果已經(jīng)在多種魚類養(yǎng)殖中得以證實，如大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[6]、龜殼攀鱸(Aanabastestudineus)[7]、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[8]、黑尾重牙鯛(Diplodussargus)[9]、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[10]。本實驗室前期探討了飼料中添加果寡糖對斜帶石斑魚生長性能和消化酶活性的影響[11]，發(fā)現(xiàn)0.05%～0.20%果寡糖能提高斜帶石斑魚的生長性能和腸道消化酶活性，筆者將進(jìn)一步探討果寡糖對斜帶石斑魚免疫功能和腸道形態(tài)的影響，以期為斜帶石斑魚養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

果寡糖：購自江蘇易實生物科技有限公司，純度>90%。

1.2 飼料配制

試驗飼料為4組等氮等能飼料，以秘魯魚粉、豆粕和蝦粉作為蛋白源，魚油和豆油作為脂肪源，面粉為糖源。試驗分4個組：基礎(chǔ)飼料組(對照組)，及3個分別在基礎(chǔ)飼料中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%以及0.20%果寡糖的試驗組?；A(chǔ)飼料配方見表1。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成 %

注：維生素預(yù)混料1和礦物質(zhì)預(yù)混料2均由廈門嘉康飼料有限公司提供.

飼料原料用錘式粉碎機(jī)粉碎后過60目分析篩，添加的微量成分采用逐級擴(kuò)大法混勻,混勻后加入35%～45%的水，然后用多功能催化劑成形機(jī)(雙螺桿制粒機(jī))制成半徑為2.5 mm的軟顆粒飼料，于室溫下風(fēng)干12 h后用自封袋分裝，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ段骨疤崆皬谋渲心贸?，室溫下放?.5 h。

1.3 試驗魚與飼養(yǎng)管理

400尾健康斜帶石斑魚幼魚在集美大學(xué)水產(chǎn)試驗場暫養(yǎng)10 d，暫養(yǎng)期間從商業(yè)料過渡到基礎(chǔ)飼料，每日投喂2次。暫養(yǎng)結(jié)束后，選取300尾健康斜帶石斑魚幼魚隨機(jī)分為4組(對照組、0.05%試驗組、0.10%試驗組、0.20%試驗組)，每組3個平行，以每缸25尾隨機(jī)投入到12個75 cm×45 cm×50 cm的玻璃水族缸中，每3個水族缸為1個試驗組，每個缸按組別投喂試驗飼料，飼養(yǎng)周期56 d。飼養(yǎng)期間，采用定時定量定點的原則投喂飼料，每日分別于8:30和17:30按照魚體質(zhì)量的1.5%投喂飼料(日投喂量為魚體質(zhì)量的3%)，投喂前先用虹吸管吸走糞便和污物，投喂30 min后再吸掉殘餌，烘干稱量質(zhì)量。養(yǎng)殖水體為一級砂濾海水，pH 8.0±0.3，鹽度24～30，水溫25～29 ℃。試驗期間水體24 h連續(xù)充氣，保證溶解氧>5 mg/L，每日換水量為40%～50%，3 d清洗1次過濾棉。

1.4 血清免疫指標(biāo)的測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，將試驗魚饑餓24 h，以丁香酚麻醉，用紗布包裹魚體并拭干表面水分，用1 mL注射器在尾靜脈取血，采集的血液置于4 ℃冰箱內(nèi)靜置，12 h后，4 ℃、3500 r/min離心10 min，收集其血清，將血清分裝到5個1.5 mL離心管，再置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)，用于溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性的測定，測定方法依據(jù)南京建成試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 腸道形態(tài)指標(biāo)的測定

采樣前禁食24 h，分別于28 d和56 d自每個缸中隨機(jī)撈取2尾魚(每組6尾)，用40 mg/L丁香酚麻醉，將魚解剖取出腸道，用滅菌0.9% NaCl溶液將腸道沖洗干凈，取約2 cm的前腸置于波恩氏液中固定12 h以上。制作切片前將其取出，按制作石蠟切片的常規(guī)法操作，乙醇逐級脫水→二甲苯透明→石蠟包埋→切片(橫切，厚度為6 μm，連續(xù)切4～6個完整橫切面)→蘇木精—伊紅染色→中性樹脂封片，用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯BX80-JPA)觀察并拍照，每張切片圖片隨機(jī)選1/4面積的絨毛，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行測量，計算腸絨毛高度、腸絨毛寬度及肌層厚度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用單因素方差分析法，Duncan法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05時表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 果寡糖對斜帶石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響

試驗28 d時，0.10%試驗組和0.20%試驗組血清超氧化物歧化酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，試驗56 d時，試驗組血清超氧化物歧化酶活性均高于對照組，其中0.20%試驗組超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。28 d時試驗組溶菌酶活性均顯著高于對照組，56 d時試驗組溶菌酶活性均高于對照組，其中0.05%試驗組和0.10%試驗組溶菌酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。試驗28 d時，各試驗組血清酸性磷酸酶活性均顯著高于對照組，試驗56 d時，各試驗組酸性磷酸酶活性均高于對照組，其中0.20%試驗組酸性磷酸酶活性顯著高于對照組(P<0.05)。28 d時，試驗組堿性磷酸酶活性均高于對照組但差異不顯著，56 d時0.05%試驗組和0.20%試驗組堿性磷酸酶活性高于對照組但差異不顯著。

表2 果寡糖對斜帶石斑魚血清免疫指標(biāo)的影響

注：數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示有顯著性差異(P<0.05).

2.2 果寡糖對斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響

各組石斑魚腸道形態(tài)較為完整，絨毛整齊致密(圖1、圖2)。各試驗組與對照組相比，絨毛高度與寬度均明顯升高，肌層厚度也有所增加。

試驗28 d和56 d時，試驗組斜帶石斑魚腸絨毛高度均高于對照組，其中28 d時0.05%試驗組和0.20%試驗組絨毛高度顯著高于對照組，56 d時0.05%試驗組和0.10%試驗組顯著高于對照組(P<0.05)(表3)。試驗28 d和56 d時，試驗組斜帶石斑魚腸絨毛寬度均顯著高于對照組(P<0.05)，28 d時，0.05%試驗組顯著高于其他試驗組(P<0.05)。試驗28 d和56 d時，0.10%試驗組腸道肌層厚度顯著高于對照組(P<0.05)，其余各組與對照組差異不顯著。

圖1 飼喂果寡糖28d時斜帶石斑魚的腸道形態(tài)(200×)a.對照組,b.0.05%試驗組,c.0.10%試驗組,d.0.20%試驗組.下同.圖2 飼喂果寡糖56d時斜帶石斑魚的腸道形態(tài)(200×)

表3 果寡糖對斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響 μm

注：數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 果寡糖對斜帶石斑魚免疫功能的影響

動物免疫系統(tǒng)包括特異性免疫與非特異性免疫，當(dāng)機(jī)體受到病原體入侵時，非特異性免疫系統(tǒng)首先發(fā)揮功能[12]。由于特異性免疫系統(tǒng)的局限性，魚類主要依賴非特異性免疫來對抗病原侵襲[13]。酸性磷酸酶作為一種機(jī)體功能調(diào)節(jié)酶，可催化磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)以及磷酸單脂的水解反應(yīng)，是免疫功能以及健康機(jī)體狀態(tài)的重要指標(biāo)[14-15]。溶菌酶在非特異性免疫的防御機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，主要作用于革蘭氏陽性菌，通過溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的黏多糖發(fā)揮免疫作用[16]。超氧化物歧化酶是魚體內(nèi)關(guān)鍵的抗氧化酶，防止體內(nèi)多余自由基對機(jī)體的傷害，與免疫水平密切相關(guān)[17]。

Zhang等[18]將0.4%和0.8%的果寡糖添加到基礎(chǔ)飼料中投喂團(tuán)頭魴28 d，試驗組血漿酸性磷酸酶活性顯著性高于對照組，且0.4%試驗組顯著高于0.8%試驗組；試驗組超氧化物歧化酶活性均高于對照組，但只有0.4%試驗組顯著高于對照組。本試驗中，投喂果寡糖相同時間(28 d)內(nèi)，0.10%和0.20%果寡糖組的超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組，添加量為0～0.20%時，超氧化物歧化酶活性隨著添加量增加而提高，這與Zhang等[18]報道的超氧化物歧化酶活性隨添加量增加呈先升后降趨勢有所不同。推測是由于在本試驗中果寡糖的添加量相對較低(0.05%～0.20%)所致。Soleimani等[19]發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)飼料中添加1%的果寡糖投喂擬鯉(Rutilusrutilus)28 d，試驗組溶菌酶活性均得到提高，并且2%和3%試驗組溶菌酶活性顯著提高。本試驗中，飼喂28 d時，試驗組溶菌酶活性同樣均高于對照組。盧明淼等[20]在基礎(chǔ)飼料中添加含有0.5、2.0、4.0 g/kg的果寡糖，并將其投喂草魚(Ctenopharyngodonidellus)8周，其中2.0 g/kg添加量的試驗組溶菌酶活性顯著高于對照組且達(dá)到峰值，且同一試驗組28 d時溶菌酶活性均高于56 d。與該結(jié)果一致，本試驗中同一試驗組28 d時溶菌酶活性均高于56 d。Ai等[21]在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%和0.4%果寡糖飼喂大黃魚(Pesudosciaenacrocea)10周，試驗組酸性磷酸酶和溶菌酶活性均顯著高于對照組，且酸性磷酸酶和溶菌酶在試驗組間均無顯著差異，該試驗結(jié)果與本試驗結(jié)果高度一致。然而，Guerreiro等[22]在15 ℃與20 ℃的水溫中，在基礎(chǔ)飼料中添加0.5%、1.0%、2.0%的果寡糖飼喂大菱鲆9周，發(fā)現(xiàn)試驗組酸性磷酸酶、溶菌酶活性與對照組相比，差異不顯著。研究表明，果寡糖對機(jī)體非特異性免疫的增強(qiáng)作用可能主要通過促進(jìn)腸道乳酸菌等有益菌的增殖來實現(xiàn)的，而該水溫(15 ℃與20 ℃)明顯低于有益菌最適生長溫度，因此果寡糖對于有益菌增殖和非特異性免疫功能的促進(jìn)作用不明顯[23-24]。與之相似，李富東等[25]發(fā)現(xiàn)，低溫條件下(15～20 ℃)飼料中添加0.5%的果寡糖飼喂褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)56 d，褐牙鲆血清中溶菌酶與對照組相比無顯著差異。由上述研究可知，果寡糖對魚類免疫功能有不同程度的促進(jìn)作用，且受添加劑量、養(yǎng)殖水體溫度等因素的影響。

3.2 果寡糖對斜帶石斑魚腸道形態(tài)的影響

腸道形態(tài)能直觀地反映腸道健康，腸絨毛長度、肌層厚度與腸道的吸收能力直接相關(guān)[26]。腸黏膜結(jié)構(gòu)的良好狀態(tài)是養(yǎng)分消化吸收和動物正常生長的生理學(xué)基礎(chǔ)，也有助于降低致病菌在腸道中的機(jī)會性感染[27]。Dimitroglou等[28]發(fā)現(xiàn)，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)幼魚基礎(chǔ)飼料中添加0.2%的甘露寡糖，魚前腸和后腸區(qū)域的微絨毛長度均顯著增加，且前腸微絨毛長度增加幅度高于后腸微絨毛長度。徐磊等[29]向飼料中分別添加60、120、240 mg/kg和480 mg/kg的甘露寡糖，發(fā)現(xiàn)肌層厚度與甘露寡糖添加量呈正相關(guān)。Abid等[30]在基礎(chǔ)飼料中添加益生菌和果寡糖飼喂大西洋鮭(Salmosalar)63 d，發(fā)現(xiàn)前腸絨毛長度顯著高于對照組，后腸絨毛長度高于對照組但不顯著。吳陽等[8]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加果寡糖能顯著提升團(tuán)頭魴的腸絨毛高度(P<0.05)，其中0.4%果寡糖組達(dá)到峰值，但當(dāng)果寡糖添加量超過0.4%時，微絨毛高度有所下降，但仍顯著性高于對照組。劉愛君等[31]發(fā)現(xiàn)，飼料中添加甘露寡糖可以提高奧尼羅非魚(Oreochromisniloticus×O.aureus)的腸絨毛高度、絨毛寬度以及絨毛密度，并在0.5%的添加量時達(dá)到峰值，而當(dāng)添加量為0.75%時，絨毛高度、寬度和密度與0.5%添加量相比有所下降。本試驗結(jié)果與吳陽等[8,31]的試驗結(jié)果較為相似，果寡糖對斜帶石斑魚幼魚腸道絨毛高度、寬度均有促進(jìn)作用，且隨著添加量的增加未呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。由于果寡糖能特異性地被益生菌所利用，從而促進(jìn)腸道微生物健康菌相的形成，而一些有害菌則會損害腸絨毛，因此，果寡糖對于腸絨毛的促進(jìn)作用可能與腸道菌群結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)有關(guān)[32-33]。

總之，飼料中添加0.05%～0.20%果寡糖能改善斜帶石斑魚的免疫功能和腸道形態(tài)，且飼料中添加0.05%果寡糖斜帶石斑魚的生長性能最佳[11]。因此，斜帶石斑魚飼料中果寡糖建議添加量為0.05%。