朱中強(qiáng),何雪,薛夢(mèng)婷,余冉
(1.東南大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院,江蘇南京,210096;2.東南大學(xué)能源熱轉(zhuǎn)換及其過程測(cè)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京,210096)
微藻是一種極其細(xì)小、肉眼不可見的自養(yǎng)植物,因其具有比一般植物更高的光合作用效率及更高的生物質(zhì)產(chǎn)量,并且生長(zhǎng)周期短、可適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)條件(如鹽堿地、沙漠等)[1-3],故在營(yíng)養(yǎng)保健食品行業(yè)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、環(huán)境治理等方面應(yīng)用廣泛。微藻具有多種代謝途徑,既可光合自養(yǎng),也可化能異養(yǎng),可混合代謝生長(zhǎng),并能在不同的培養(yǎng)條件下,通過改變其合成蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)的途徑實(shí)現(xiàn)其自身增殖[4]。而微藻的混合代謝模式可幫助其利用廢水中的有機(jī)物并減少其自養(yǎng)生長(zhǎng)對(duì)光的依賴[5-6],從而同步實(shí)現(xiàn)廢水凈化與資源的有效利用。目前,微藻養(yǎng)殖種類主要包括小球藻、螺旋藻、柵藻,其中,小球藻生長(zhǎng)速率快,固碳效率高,pH 適應(yīng)性廣,因而,成為應(yīng)用與研究的熱點(diǎn)。人們對(duì)小球藻的廢水養(yǎng)殖技術(shù)已有一定研究,在光照條件下,二氧化碳和廢水中的有機(jī)物可協(xié)同促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)[7]。LU等[8]利用小球藻處理肉類加工廢水,發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在混合廢水中的小球藻的生物量比分別生長(zhǎng)在單一廢水和培養(yǎng)基中的高,達(dá)到0.68~1.54 g/L,此外,氨氮去除率(68.75%~80.3%)和總氮去除率(30.06%~50.94%)也有不同程度地提高。GE等[9]利用厭氧消化液分別自養(yǎng)、異養(yǎng)、混合培養(yǎng)小球藻,發(fā)現(xiàn)相比于其他2種培養(yǎng)模式,在混合模式下的小球藻具有更高的生長(zhǎng)量((0.72±0.01)g/L)和更高質(zhì)量濃度的葉綠素((14.2±0.1)g/L)及類胡羅素((12.9±0.4)g/L),并且氮磷污染物幾乎全部去除。我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,隨之產(chǎn)生的畜禽養(yǎng)殖廢水的有效處理問題受到廣泛關(guān)注。目前,該類廢水的典型處理工藝有水解-序批式活性污泥工藝(SBR)、氧化溝工藝等,但這些工藝都存在操作復(fù)雜、成本較高的缺點(diǎn)。然而,畜禽養(yǎng)殖廢水具有氨氮濃度高、有機(jī)物濃度高的特點(diǎn),其中部分有機(jī)物可用于回收再利用。雖然已有研究表明,利用畜禽養(yǎng)殖廢水進(jìn)行微藻養(yǎng)殖具有可行性,但該模式下微藻固碳機(jī)理的研究仍然較少,為此,本文作者研究小球藻對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢水的凈化能力以及廢水與小球藻代謝生長(zhǎng)的協(xié)同作用關(guān)系與機(jī)理,重點(diǎn)探討小球藻對(duì)有機(jī)與無機(jī)碳源的競(jìng)爭(zhēng)利用策略,小球藻細(xì)胞增殖速率與合成代謝產(chǎn)物(色素、油脂)含量的關(guān)系,并解析有機(jī)碳利用的影響因素與小球藻固碳機(jī)理,以期為畜禽養(yǎng)殖廢水的小球藻凈化工藝提供參考。
實(shí)驗(yàn)所用的小球藻(Chlorella vulgaris)(FACHB-8)購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所(中國(guó),武漢)。采用高溫滅菌(121 ℃,30 min)后的BG11培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
本次廢水處理裝置示意圖如圖1所示,具體包括藻培養(yǎng)系統(tǒng)及pH控制系統(tǒng)(控制pH為7.5±0.5)。反應(yīng)器容積為1 L,有效容積為400 mL。反應(yīng)器試驗(yàn)全程置于光照培養(yǎng)箱(溫度為28 ℃,光暗時(shí)間比為12 h:12 h,光照強(qiáng)度為56.67 W/m2)。
圖1 廢水處理裝置示意圖Fig.1 Diagram of wastewater treatment device
試驗(yàn)用廢水參考南京市某養(yǎng)殖中心的廢水成分進(jìn)行人工配制,模擬廢水以C6H12O6為碳源,以NH4Cl為氮源、以K2HPO4為磷源,添加必需金屬元素。模擬廢水組分如下:1.000 g/L C6H12O6;0.200 g/L NH4Cl;0.040 g/L K2HPO4;0.075 g/L MgSO4·7H2O;0.036 g/L CaCl2·2H2O; 0.003 g/L FeCl3·6H2O;1 mL/L A5(痕量金屬溶液)。其中,A5 組分如下:2.86 g/L H3BO3; 1.86 g/L MnCl2·4H2O; 0.22 g/L ZnSO4·7H2O; 0.39 g/L Na2MoO4·2H2O; 0.08 g/L CuSO4·5H2O;0.05 g/L Co(NO3)2·6H2O。模擬廢水(接種后)成分如表1所示。
表1 模擬廢水成分(質(zhì)量濃度)Table1 Composition of simulated wastewater mg/L
考慮到pH 對(duì)藻類生長(zhǎng)及固碳機(jī)理的影響,為研究小球藻對(duì)無機(jī)碳(HCO-3)和有機(jī)碳的競(jìng)爭(zhēng)利用規(guī)律,在模擬水質(zhì)基礎(chǔ)上分別采用NaHCO3和Na2CO3組合以及4-羥乙基哌嗪丙磺酸(HEPPS)作為模擬廢水的pH緩沖劑,分別設(shè)置4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組(見表2),以對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)組中初始的無機(jī)碳濃度,同時(shí)避免小球藻培養(yǎng)過程中為調(diào)節(jié)pH而投加無機(jī)碳源對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。其中HEPPS 作為一種生物緩沖劑,對(duì)細(xì)胞無毒性作用,且不能夠被細(xì)胞利用,故可以作為緩沖劑而不會(huì)增加培養(yǎng)液中的有機(jī)碳濃度。
表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table2 Experimental design schemes
將小球藻先于BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),待生長(zhǎng)至穩(wěn)定期(10 d)后,按照1:50 體積比分別接種進(jìn)4 個(gè)(分別編號(hào)為A,B,C 和D 組)裝有400 mL 高溫滅菌(121 ℃,30 min)廢水的反應(yīng)器中進(jìn)行序批式培養(yǎng),監(jiān)測(cè)小球藻的生長(zhǎng)及水質(zhì)變化情況。同時(shí),監(jiān)測(cè)藻細(xì)胞內(nèi)色素、油脂的含量變化,每批實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。
1.5.1 藻生長(zhǎng)情況及比生長(zhǎng)速率計(jì)算
在波長(zhǎng)為680 nm條件下,利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度表征藻的生長(zhǎng)情況。比生長(zhǎng)速率計(jì)算公式如下:
式中:μ為比生長(zhǎng)速率,d-1;t為小球藻的培養(yǎng)時(shí)間,d;Nt和N0分別為第t天和初始時(shí)測(cè)定的藻密度。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在藻培養(yǎng)過程中,前3 d為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,因此,在計(jì)算比生長(zhǎng)速率時(shí),統(tǒng)一取第3天藻密度和初始藻密度進(jìn)行計(jì)算,即t=3,Nt為N3。
1.5.2 廢水中成分測(cè)定
取適量的小球藻液,以8 000 r/min 離心5 min 后取上清過濾(濾膜孔徑為0.45 μm)。采用納氏試劑光度法測(cè)定NH+4-N濃度,采用堿性-過硫酸鉀分光光度法測(cè)定總氮(TN)質(zhì)量。采用鉬酸銨分光光度法測(cè)定總磷(TP)質(zhì)量[10];采用快速消解法測(cè)定COD 質(zhì)量濃度[11]。由于實(shí)驗(yàn)組中添加的生物緩沖劑會(huì)體現(xiàn)為COD 質(zhì)量濃度,但不可被小球藻利用,因此,添加有生物緩沖劑的實(shí)驗(yàn)組中COD 質(zhì)量濃度的計(jì)算公式如下:
式中:ρCOD,A為小球藻可以利用的COD 質(zhì)量濃度,mg/L;ρCOD,M為測(cè)定的COD 質(zhì)量濃度,mg/L;ρCOD,H為添加生物緩沖劑后體現(xiàn)的COD質(zhì)量濃度,mg/L。
1.5.3 色素及油脂測(cè)定
采取分光光度法測(cè)定色素的含量(葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素)[12];采用氯仿-甲醇法測(cè)定油脂質(zhì)量[13]。
本文實(shí)驗(yàn)測(cè)得的藻生物量以及COD,TN,TP,NH4-N 和葉綠素的質(zhì)量濃度、脂質(zhì)質(zhì)量等采用Excel進(jìn)行分析,并表示為T±ΔT,其中T為各指標(biāo)的平均值,ΔT為各指標(biāo)的平均偏差,并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)。當(dāng)概率p<0.05時(shí)說明結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1.1 小球藻的生長(zhǎng)
小球藻在模擬畜禽養(yǎng)殖廢水中的生長(zhǎng)情況對(duì)比如圖2所示。其中,“*”表示該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與C組實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比具有顯著性差異(p<0.05);“&”表示該組實(shí)驗(yàn)結(jié)果與D 實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比具有顯著性差異(p<0.05)。由圖2可知:無機(jī)碳的添加不影響小球藻的生長(zhǎng)周期,4 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小球藻在經(jīng)過1 d 的適應(yīng)期后,均快速進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,在第3天時(shí)小球藻的生物量達(dá)到最大,并逐漸進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期(見圖2(a))。其中,B 實(shí)驗(yàn)組(以HEPPS 為初始緩沖液,用NaHCO3調(diào)節(jié)pH)中的小球藻經(jīng)過7 d 培養(yǎng)后,生物量達(dá)到最大。由于初始無機(jī)碳的存在,小球藻的生長(zhǎng)速率以及達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)的生物量明顯降低(見圖2(b))。當(dāng)pH為7.0~8.0 時(shí),CO2在液相的主要存在形式為可被藻類吸收利用的。A 和B 組中的小球藻經(jīng)過7 d 培養(yǎng),藻的生物量并沒有顯著性差異(p>0.05),但均明顯高于C 和D 實(shí)驗(yàn)組的小球藻生物量(p<0.05)。這說明當(dāng)缺少無機(jī)碳源時(shí),小球藻可以通過改變其代謝途徑對(duì)廢水中有機(jī)碳源進(jìn)行吸收,以滿足藻類生長(zhǎng)的需要[15];另一方面,在以空氣中的CO為無機(jī)碳源且水中溶解性無機(jī)碳極少的情況下,可能會(huì)引發(fā)藻細(xì)胞內(nèi)的“二氧化碳濃縮機(jī)制”[16],藻細(xì)胞可以主動(dòng)運(yùn)輸HCO-3或者在微藻胞內(nèi)和胞外酶共同作用下將HCO-3轉(zhuǎn)化為CO2擴(kuò)散至細(xì)胞內(nèi),使得小球藻在無機(jī)碳源受限時(shí)依然可維持快速增長(zhǎng)。但是B實(shí)驗(yàn)組中小球藻的比生長(zhǎng)速率仍然明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組中小球藻的比生長(zhǎng)速率(p<0.05),說明適當(dāng)添加無機(jī)碳源利于藻的快速增長(zhǎng)。這可能是由于藻類在生長(zhǎng)過程中,為保持體內(nèi)平衡而向外分泌H+與HCO-3,二者反應(yīng)后釋放出CO2,通過擴(kuò)散作用快速被藻類吸收[17]。C 和D 實(shí)驗(yàn)組中藻的生長(zhǎng)速率和藻的密度明顯比A 和B 組中的低,說明添加過量無機(jī)碳源(HCO3-)可能使藻類合成碳的途徑發(fā)生改變,并對(duì)有機(jī)碳的有效吸收產(chǎn)生負(fù)面影響,從而抑制了高質(zhì)量濃度有機(jī)碳條件下藻的生長(zhǎng)[18]。因此,當(dāng)pH為7.0~8.0時(shí),添加一定量的無機(jī)碳(HCO-3)能夠促進(jìn)高質(zhì)量濃度有機(jī)碳培養(yǎng)條件下藻的生長(zhǎng),但過高濃度的無機(jī)碳會(huì)抑制藻的生長(zhǎng)。
圖2 小球藻在模擬畜禽養(yǎng)殖廢水中的生長(zhǎng)情況對(duì)比Fig.2 Comparison of growth of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater
2.1.2 無機(jī)碳對(duì)水質(zhì)凈化的影響
模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中COD 質(zhì)量濃度變化如圖3所示。由圖3可知:利用模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中,所有實(shí)驗(yàn)組中廢水的ρCOD均隨著小球藻的生長(zhǎng)而明顯降低。A~D實(shí)驗(yàn)組ρCOD去除率在7 d 培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)分別為(91.0±1.3)%,(77.8±14.4)%,(68.8±5.6)%和(64.8±12.1)%,但除A 組外,ρCOD均呈現(xiàn)出先減少后緩慢增加的趨勢(shì);同時(shí),C實(shí)驗(yàn)組中ρCOD分別為A 和B 這2 組ρCOD的5.9 倍與1.4倍,D實(shí)驗(yàn)組中的ρCOD分別為A和B這2組ρCOD的6.7倍與1.5 倍。由于碳源存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,小球藻可能優(yōu)先吸收無機(jī)碳,從而影響了有機(jī)碳的吸收。B實(shí)驗(yàn)組的ρCOD經(jīng)過2 d 培養(yǎng)后迅速降至(46.8±16.9)mg/L,顯著小于同時(shí)期其他實(shí)驗(yàn)組的ρCOD(p<0.05)。在藻類對(duì)數(shù)增長(zhǎng)末期,所有實(shí)驗(yàn)組藻類的ρCOD隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸上升,這可能是因?yàn)樵逑虬夥置谟袡C(jī)物。
圖3 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中ρCOD變化Fig.3 Change of ρCOD during cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater
氮是藻類細(xì)胞的重要組成成分,對(duì)藻的結(jié)構(gòu)蛋白、酶、核酸及葉綠素等合成至關(guān)重要[19]。模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中氨氮和總氮的質(zhì)量濃度變化如圖4所示。由圖4可知:隨著小球藻的生長(zhǎng),氨氮和總氮的質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)下降趨勢(shì);A~D 實(shí)驗(yàn)組中小球藻對(duì)氨氮去除率均達(dá)到100%,總氮的去除率分別為(96.5±2.7)% , (97.0±0.6)% , (96.9±1.1)% 和(96.8±0.5)%,但是,各個(gè)實(shí)驗(yàn)組出水總氮質(zhì)量濃度并無顯著性差異,且均達(dá)到城鎮(zhèn)污水廠一級(jí)A 的排放標(biāo)準(zhǔn)(總氮質(zhì)量濃度<15 mg/L)。由此可見,添加無機(jī)碳對(duì)氨氮和總氮的去除影響不顯著。
圖4 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中氨氮與總氮質(zhì)量濃度變化Fig.4 Changes of ammonia nitrogen and total nitrogen mass concentrations during the cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater
圖5 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中總磷質(zhì)量濃度的變化Fig.5 Change of total phosphorus mass concentration during the cultivation of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater
磷是藻類生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一,它可以影響藻類磷脂、蛋白質(zhì)和核酸的合成,并且對(duì)能量循環(huán)具有重要作用[20-21]。模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻過程中總磷質(zhì)量濃度的變化如圖5所示。由圖5可知:隨著小球藻培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),A~D 組廢水中總磷質(zhì)量濃度都呈現(xiàn)下降趨勢(shì),最終總磷去除率均大于80%。A 和B 實(shí)驗(yàn)組的總磷去除率分別為(86.8±3.9)%和(86.8±2.8)%),比C和D實(shí)驗(yàn)組的總磷去除率(分別為(83.4±1.7)%和(83.3±5.7)%)略高,但C 和D 實(shí)驗(yàn)組中的最終出水總磷質(zhì)量濃度與A和B實(shí)驗(yàn)組中的總磷質(zhì)量濃度并沒有顯著性差異(p>0.05)。因此,當(dāng)利用畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)小球藻時(shí),是否添加無機(jī)碳對(duì)廢水中總磷的去除無影響。
2.1.3 小球藻胞內(nèi)色素、油脂質(zhì)量變化
在小球藻培養(yǎng)過程中,無機(jī)碳濃度對(duì)油脂在藻細(xì)胞中積累量的影響如圖6所示。由圖6可知:經(jīng)過7 d培養(yǎng),B 實(shí)驗(yàn)組中單個(gè)小球藻細(xì)胞內(nèi)的油脂質(zhì)量為(0.26±0.004)ng,顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞的油脂質(zhì)量(p<0.05)。這是因?yàn)椋m量無機(jī)碳源的添加可能促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的吸收與油脂的轉(zhuǎn)化積累;另一方面,B 實(shí)驗(yàn)組藻的生長(zhǎng)速率較快,加快了其對(duì)氮的消耗,導(dǎo)致生長(zhǎng)過程中提前形成了“氮饑餓”,從而更利于油脂的積累[22-24]。但無機(jī)碳的過量添加明顯抑制藻細(xì)胞對(duì)油脂的轉(zhuǎn)化積累,從而導(dǎo)致A和B組的藻細(xì)胞油脂質(zhì)量均顯著高于C和D組的藻細(xì)胞油脂質(zhì)量。
圖6 模擬畜禽養(yǎng)殖廢水培養(yǎng)的小球藻油脂積累情況Fig.6 Accumulation of oil of Chlorella vulgaris in simulated livestock and poultry aquaculture wastewater
圖7 模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素與類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化Fig.7 Changes of chlorophyll a,chlorophyll b,total chlorophyll and carotenoid mass concentrations in process of cultivating Chlorella vulgaris in simulated wastewater
葉綠素是小球藻進(jìn)行光合作用的重要色素,其質(zhì)量濃度直接影響小球藻光合效率和自養(yǎng)生長(zhǎng)速率[25]。類胡蘿卜素在捕集光能、維持光合作用和消除多余能量等方面具有重要作用[26]。模擬廢水培養(yǎng)小球藻過程中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素與類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化如圖7所示。由圖7可見:小球藻中測(cè)得的各葉綠素質(zhì)量濃度均呈先增加后減小趨勢(shì),其中,B實(shí)驗(yàn)組中各類葉綠素的質(zhì)量濃度在對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期末期(第4 天)均明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組中各類葉綠素的質(zhì)量濃度;在第3和第4天(即小球藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)末期與平臺(tái)期)時(shí),實(shí)驗(yàn)組A和實(shí)驗(yàn)組B中的葉綠素a和葉綠素b 的質(zhì)量濃度與第5 天時(shí)的并無顯著性差異(p>0.05),表明這2 個(gè)實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞中葉綠素a 和葉綠素b的質(zhì)量濃度達(dá)到最大并穩(wěn)定一段時(shí)間后逐漸減少,而實(shí)驗(yàn)組C和實(shí)驗(yàn)組D的變化規(guī)律類似,在第3天時(shí)達(dá)到最大后迅速下降后并逐漸趨于穩(wěn)定。其中,B 組葉綠素a 質(zhì)量濃度最高達(dá)(8.43±0.17)mg/L,比同時(shí)期的A,C 和D 組中葉綠素a 質(zhì)量濃度高34.1%,133.7%和56.4%。但是經(jīng)過7 d培養(yǎng),B組中葉綠素a質(zhì)量濃度卻顯著低于A組葉綠素a質(zhì)量濃度(p<0.05),說明經(jīng)過7 d 培養(yǎng),B 實(shí)驗(yàn)組的光合效率明顯下降。這是因?yàn)椋?天時(shí)B組的小球藻生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于A 組的小球藻生長(zhǎng)情況(p<0.05)(見圖2),B 組小球藻對(duì)模擬廢水中Mg2+的吸收增加,導(dǎo)致第7天時(shí)B組中的小球藻在缺鎂條件下生長(zhǎng),嚴(yán)重影響B(tài)組葉綠素的合成[27],故7 d 后B 組的葉綠素質(zhì)量濃度顯著低于A組的葉綠素質(zhì)量濃度。另外,葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素質(zhì)量濃度的變化趨勢(shì)與葉綠素a 的均一致。A和B組的總?cè)~綠素和類胡蘿卜素水平明顯比同期的C和D組的高,說明適量的無機(jī)碳可促進(jìn)藻的光合作用,從而可釋放更多的能量用于藻對(duì)有機(jī)碳的吸收(見圖3)。
1)小球藻可在有效凈化高質(zhì)量濃度有機(jī)畜禽廢水的同時(shí)完成自身增殖,有機(jī)物、總氮、總磷和NH+4-N 的去除率分別高達(dá)(91.0±1.3)%,(97.0±0.6)%,(86.8±3.8)%和100%。
2)一定濃度的無機(jī)碳(0.1~1 μmoL/L)可以促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)及其對(duì)有機(jī)物的吸收,COD 去除率可提高12.9 %~40.4%,同時(shí),油脂和葉綠素轉(zhuǎn)化積累能力也有一定程度提高。