耐受全氟辛酸細(xì)菌的篩選及其對(duì)脅迫的生理響應(yīng)

易浪波，柴立元，彭清忠，唐崇儉，周璐璐

(1.中南大學(xué)冶金與環(huán)境學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410083；2.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首，416000)

全氟化合物(perfluorinated compounds，PFCs)指氫原子全部被氟取代的鹵代有機(jī)化合物，具備優(yōu)良的穩(wěn)定性、表面活性和疏水疏油等特性[1-2]。全氟辛酸(perfluorooctane acid,PFOA)作為PFCs 的典型代表之一，過去幾十年廣泛應(yīng)用于機(jī)械、紡織、石化、電子、輕工、汽車、航空航天等行業(yè)[3-5]。隨著其大量使用，近些年在多種環(huán)境介質(zhì)、生物體和人體中不斷被檢測(cè)出，從人群密集的城市到少有人類活動(dòng)的極地區(qū)域，呈現(xiàn)出全球分布態(tài)勢(shì)[6]。由于PFOA 污染廣、性質(zhì)極其穩(wěn)定、生物蓄積性強(qiáng)、毒性高，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類健康和整個(gè)生態(tài)環(huán)境的安全[7]，成為繼多氯聯(lián)苯和二噁英之后日益引起人們重視的新型持久性有機(jī)污染物(POPs)。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者陸續(xù)開展微生物降解PFOA 的研究工作，如薛學(xué)佳等[8]通過馴化篩選得到可利用氟代有機(jī)化合物為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌Z1和Z3，經(jīng)LG-MS檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)全氟辛酸分子中與羧基相鄰碳的1 個(gè)氟被氫取代。何海濤等[9]通過富集篩選獲得降解PFOA 的克雷白氏桿菌(Klebsiellasp.)。SCHR?DER 等[10-11]證明在嚴(yán)格限定氧的條件下活性污泥能降解PFOA。但這些微生物降解PFOA 效率低，除了PFOA具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，其強(qiáng)的生物毒性抑制微生物生長(zhǎng)也是重要原因。因此，篩選耐受PFOA 能力強(qiáng)的降解菌是生物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用的前提。微生物在生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要角色，其生物特性與生態(tài)系統(tǒng)的功能密切相關(guān)[12]。微生物在受到PFOA等不利環(huán)境脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生活性氧自由基(ROS)，誘導(dǎo)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，引起微生物的損傷甚至凋亡。生物體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)對(duì)氧化脅迫極為敏感，其活性可以間接反映機(jī)體細(xì)胞中ROS 的濃度，因此，測(cè)試表征ROS 水平的指標(biāo)，如丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、ATP 酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等的活性變化能監(jiān)測(cè)微生物對(duì)PFOA 脅迫的生理響應(yīng)，理解微生物對(duì)PFOA脅迫的適應(yīng)性和耐受機(jī)制。本研究從長(zhǎng)期受氟化物污染的環(huán)境中篩選能以PFOA為唯一碳源生長(zhǎng)的優(yōu)良菌株，研究其在PFOA脅迫下的耐受能力和生理響應(yīng)及其耐受機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

采集武漢某氟化物工廠污水處理中心的活性污泥，共6 份，分別裝入無(wú)菌塑料袋，低溫運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基各種組分的質(zhì)量濃度如下：NaCl 為2 g/L，KH2PO4為1 g/L，NH4NO3為5 g/L， K2HPO4為1 g/L，CaCl2?2H2O 為0.05 g/L，MgSO4?7H2O 為0.5 g/L，酵母膏為1 g/L；根據(jù)需要添加不同質(zhì)量的PFOA。pH 為7.0，實(shí)驗(yàn) 壓力為1.01×105Pa，并在120 ℃條件下滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基(改良的無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基)的質(zhì)量濃度如下：NaCl為2 g/L，KH2PO4為1 g/L，NH4NO3為5 g/L，K2HPO4為1 g/L，CaCl2?2H2O 為0.05 g/L，MgSO4?7H2O 為0.5 g/L，PFOA 為500 mg/L；pH 為7.0，實(shí)驗(yàn)壓力為1.01×105Pa，并在120 ℃條件下滅菌20 min。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加瓊脂粉15 g/L。

鑒定培養(yǎng)基(改良的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)的質(zhì)量濃度如下：酵母膏為5 g/L，蛋白胨為10 g/L，NaCl為10 g/L，PFOA 為500 mg/L；pH 為7.0，實(shí)驗(yàn)壓力為1.01×105Pa，在120 ℃條件下滅菌20 min，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加瓊脂粉15 g/L。

葡萄糖無(wú)機(jī)鹽離子培養(yǎng)基的質(zhì)量濃度如下：NaCl 為2 g/L，KH2PO4為1 g/L，NH4NO3為5 g/L，K2HPO4為1 g/L，CaCl2?2H2O 為0.05 g/L，MgSO4?7H2O為0.5 g/L，PFOA為500 mg/L，葡萄糖2為g/L；pH 為7.0，實(shí)驗(yàn)壓力為1.01×105Pa，在115 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 儀器與試劑

提取細(xì)菌基因組DNA，PCR 擴(kuò)增所用酶和試劑均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，PFOA(純度98%)購(gòu)自Sigma 公司，MDA，ATP，SOD，CAT 和GST等酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其他分析純化學(xué)試劑購(gòu)自湖南科化工貿(mào)有限公司。配置PFOA溶液和振蕩實(shí)驗(yàn)所用器皿均為聚丙烯容器。

實(shí)驗(yàn)儀器：J810R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德股份公司)；ABI-2720 PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI 公司)，Tanon 1600R全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；JY98-iiin 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(新芝生物科技股份有限公司)；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)；FC酶標(biāo)儀(美國(guó)熱電)；125 mL和500 mL聚丙烯錐形瓶(美國(guó)樂基因)。

1.2 方法

1.2.1 PFOA耐受細(xì)菌的分離

將6 份樣品混合均勻，隨機(jī)稱取5 g 樣品接種于95 mL PFOA 質(zhì)量濃度為150 mg/L 的富集培養(yǎng)基中，于30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min下振蕩培養(yǎng)，每7 d以5%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮富集培養(yǎng)基中，每轉(zhuǎn)接2 次，PFOA的質(zhì)量濃度增加50 mg/L，當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度增至500 mg/L 時(shí)，繼續(xù)傳代培養(yǎng)4 周，菌株馴化結(jié)束。取經(jīng)馴化的菌液5 mL 轉(zhuǎn)入95 mL 篩選培養(yǎng)基中，于30 ℃，轉(zhuǎn)速160 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次。取1 mL菌液按梯度稀釋至10-6，吸取0.1 mL稀釋液涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，于30 ℃倒置培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落進(jìn)行傳代純化。純化后的菌株用15%的甘油于-70 ℃保存。

1.2.2 菌株鑒定

1)菌株的形態(tài)及生理生化特性。將富集純化的菌株接種于鑒定培養(yǎng)基上，于35 ℃培養(yǎng)96 h，觀察菌落形態(tài)特征。各細(xì)菌菌株生理生化特性檢測(cè)按文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。

2)16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析。采用CTAB法提取細(xì)菌總DNA，以其為模板，利用16S rRNA 基 因 通 用 引 物 PA： 5′ -AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′ 和 PB： 5′ -TTAAGGTGAT CCAGCCGCA-3′ 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序如下：于95 ℃預(yù)變性5 min，于95 ℃變性30 s，于55 ℃退火30 s，于72 ℃延伸80 s，經(jīng)過30 個(gè)循環(huán)，最后于72 ℃延伸10 min。經(jīng)電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

將測(cè)序所得16S rRNA基因序列用BLAST軟件在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，下載相似性較高的16S rRNA 基因序列，采用CLUSTAL-X 軟件多重比對(duì)序列，系統(tǒng)進(jìn)化距離矩陣根據(jù)Kimura 模型估算，用MEGA 4.0軟件進(jìn)行聚類分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.2.3 菌株對(duì)PFOA的耐受性測(cè)定

從平板上挑取單菌落接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min 振蕩培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌液10 mL，在轉(zhuǎn)速6 000 r/min 下離心5 min，棄上清，加無(wú)菌水10 mL 混勻水洗，如此重復(fù)3 次，制備在600 nm 下吸光度(OD600)為2.0 的菌懸液。

配置PFOA甲醇母液，經(jīng)濾膜過濾除菌，分別加入至300 mL 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，使PFOA 質(zhì)量濃度分別為0，300，600，900，1 200 和1 500 mg/L。培養(yǎng)基振蕩30 min脫除甲醇后，接入0.3 mL菌懸液，于30 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min 條件下培養(yǎng)，定期取樣測(cè)定菌液OD600，考察菌株對(duì)PFOA的耐受性。

1.2.4 PFOA質(zhì)量濃度對(duì)菌株酶活的影響

根據(jù)菌株對(duì)PFOA 的耐受程度，分別設(shè)置對(duì)照(0 mg/L)和低(600 mg/L)、中(900 mg/L)、高(1 200 mg/L)共4 個(gè)PFOA 處理質(zhì)量濃度組，按1%的接菌量將菌株接種至LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)，每24 h 取樣60 mL，于6 000 r/min 離心10 min，棄上清，用PBS緩沖液洗2次，并重懸，于冰浴超聲破碎(功率300 W，開3 s，停5 s)10 min，然后將樣品分成3 份：第1 份于1 000 r/min 離心5 min 后，取上清液2 mL測(cè)定ATP酶活性；第2份在4 ℃、轉(zhuǎn)速3 000 r/min下離心10 min，取上清測(cè)定蛋白質(zhì)，SOD，CAT和GST酶活性；第3 份在10 000 r/min 下離心10 min，取上清液測(cè)定MDA 濃度。MDA 質(zhì)量摩爾濃度，ATP 酶，SOD 酶、CAT 活性和還原性GSH 酶均采用可見分光光度法測(cè)定，測(cè)定方法按照試劑盒的說明。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用3次平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，并采用origin8.5繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離、形態(tài)及生理生化特性

經(jīng)長(zhǎng)期梯度壓力馴化和富集篩選，分離獲得4株細(xì)菌，分別編號(hào)為YAB-1，YAB-2，YAB-3 和YAB-4。根據(jù)馴化的最終質(zhì)量濃度可知這4 株細(xì)菌至少能耐受500 mg/L的PFOA，且能在PFOA 為唯一碳源的篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明其能轉(zhuǎn)化利用PFOA。將4株菌分別接種至LB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3 d后，菌落形態(tài)如圖1所示。

由圖1可見：YAB-1 菌落直徑為1.5～2.5 mm，呈金黃色，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，圓形隆起；YAB-2菌落直徑0.5～1.0 mm，呈淡黃色，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，圓形隆起；YAB-3 菌落呈乳白色，表面較干燥，邊緣不整齊，扁平難挑起；YAB-4 菌落直徑1.0～2.0 mm，半透明乳白色，表面濕潤(rùn)，邊緣整齊，圓形隆起。

分離菌株的革蘭氏染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：菌株YAB-2為革蘭氏陽(yáng)性菌，其他3株細(xì)菌為革蘭氏陰性菌。部分生理生化反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

2.2 16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 細(xì)菌菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphological characters of isolates

表1 菌株的生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table1 Physiological and biochemical characteristics of the isolates

圖2 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的菌株與其相似性較高典型菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed based on 16S rRNA gene sequence analysis showing phylogenetic relationships among strains and other related taxa

以4 株細(xì)菌基因組DNA 為模板，利用PCR 成功擴(kuò)增出16S rRNA 基因片段，PCR 產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序、序列校對(duì)后與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度較高的同源序列進(jìn)行多重比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(見圖2)。結(jié)果表明：菌株YAB-1 以99.86%的相似值與Pseudomonas parafulva(NR 040859)聚為一支；菌株YAB-2 與Staphylococcusaureus(MH496642)序列同源性為99%；菌株YAB-3與Pseudomonassp.(JX416381)聚在一起，16S rRNA 基因序列同源性達(dá)99%；YAB-4與蒼白桿菌屬菌株處于同一分支，與Ochrobactrum anthropi(KM8994186)的同源性達(dá)99%；結(jié)合其菌落形態(tài)和生理生化特性，鑒定菌株YAB-1，YAB-2，YAB-3和YAB-4分屬于類黃色假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)。

2.3 菌株對(duì)PFOA的耐受能力

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按1%的接菌量接種測(cè)試菌至低、中、高這3種PFOA質(zhì)量濃度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中考察各細(xì)菌對(duì)PFOA的耐受情況，圖3所示為不同質(zhì)量濃度PFOA處理下菌株的生長(zhǎng)曲線。

由圖3(a)可知：當(dāng)菌株YAB-1 在PFOA 質(zhì)量濃度為900 mg/L 和1 200 mg/L 時(shí)，其生長(zhǎng)規(guī)律符合微生物典型的生長(zhǎng)曲線，而當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度為1 500 mg/L時(shí)，菌株YAB-1 不能生長(zhǎng)。菌株YAB-1 在900 mg/L PFOA 脅迫下能較好生長(zhǎng)，最大吸光度OD600可達(dá)3.238 3。當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度為1 200 mg/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，生物量顯著降低，最大OD600僅為1.369 0。當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度為1 500 mg/L時(shí)，PFOA對(duì)菌株毒害作用顯著，菌體幾乎不增長(zhǎng)，菌液OD600接近0。

由圖3(b)可知：當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)菌株YAB-2生長(zhǎng)良好(最大OD600為2.705 5)；當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度為600 mg/L 時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到一定程度抑制；當(dāng)受到900 mg/L PFOA 脅迫時(shí)，菌株YAB-2 不生長(zhǎng)。

由圖3(c)可知：菌株YAB-3 在PFOA 質(zhì)量濃度梯度設(shè)置與YAB-2 相同的條件下，生長(zhǎng)規(guī)律也類似。菌株YAB-4 對(duì)PFOA 的耐受情況如圖3(d)所示，在600 mg/L PFOA 脅迫下生長(zhǎng)良好，在900 mg/L PFOA脅迫下菌株生長(zhǎng)顯著降低，菌液最大OD600僅為0.465 9；當(dāng)PFOA為1 200 mg/L時(shí)，菌株YAB-4無(wú)法生長(zhǎng)。

PFOA對(duì)菌株有一定的毒害作用，高質(zhì)量濃度的PFOA 會(huì)顯著抑制菌體增值，但4 株菌仍表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性和生長(zhǎng)適應(yīng)性，這可能與其篩選于長(zhǎng)期受PFOA 污染的樣品有關(guān)。比較4 株菌對(duì)PFOA 的耐受性發(fā)現(xiàn)，不同菌株的耐受能力不同，所能承受的PFOA 脅迫質(zhì)量濃度也不一樣，菌株YAB-1 對(duì)PFOA的耐受性最強(qiáng)，其次是YAB-4，而菌株YAB-2 和YAB-3的耐受能力較弱。

圖3 PFOA處理下菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of the isolates in presence of PFOA

2.4 PFOA對(duì)菌株YAB-1的生理毒性

2.4.1 MDA質(zhì)量摩爾濃度

生物細(xì)胞內(nèi)濃度過高的活性氧會(huì)攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸，進(jìn)而影響膜的流動(dòng)性與穩(wěn)定性。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一，是評(píng)價(jià)膜脂過氧化和細(xì)胞受脅迫程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)[14]。圖4所示為PFOA對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響。由圖4可見：培養(yǎng)基中不添加PFOA的對(duì)照組，菌體MDA 質(zhì)量摩爾濃度無(wú)明顯變化；當(dāng)菌株YAB-1 被脅迫24 h 時(shí)，PFOA 質(zhì)量濃度越高，MDA 質(zhì)量摩爾濃度越高；當(dāng)PFOA 質(zhì)量濃度為1 200 mg/L 時(shí)MDA 質(zhì)量摩爾濃度達(dá)最高值，為19.2 nmol/g；當(dāng)脅迫32 h時(shí)，MDA 質(zhì)量摩爾濃度變化隨PFOA 質(zhì)量濃度提高而逐步升高，但在高質(zhì)量濃度PFOA 脅迫下MDA 質(zhì)量摩爾濃度較脅迫24 h已顯著降低。當(dāng)脅迫48 h時(shí)，低質(zhì)量濃度和中等質(zhì)量濃度PFOA 脅迫能引起MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，高質(zhì)量濃度PFOA 脅迫會(huì)使MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著降低。以上結(jié)果表明：低質(zhì)量濃度PFOA 短期脅迫菌株YAB-1 細(xì)胞的MDA 質(zhì)量摩爾濃度無(wú)顯著變化，長(zhǎng)期脅迫會(huì)使MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著上升；高質(zhì)量濃度PFOA 短期脅迫則使MDA 質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，長(zhǎng)期脅迫可使菌體MDA質(zhì)量摩爾濃度顯著降低。

圖4 PFOA 對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞MDA 濃度的影響Fig.4 Effect of different time and PFOA concentrations on MDA of strain YAB-1

2.4.2 ATP酶活性

在PFOA 脅迫下，菌株YAB-1 細(xì)胞膜Na+K+-ATPase 和Ca2+Mg2+-ATPase 酶活性變化規(guī)律如圖5所示。菌株YAB-1在沒有PFOA脅迫下，Na+K+-ATPase和Ca2+Mg2+-ATPase 酶活性無(wú)顯著變化；低質(zhì)量濃度PFOA 脅迫能引起Na+K+-ATPase 酶活性持續(xù)顯著升高，而Ca2+Mg2+-ATPase 酶活性自24 h 顯著升高后維持穩(wěn)定。中等質(zhì)量濃度PFOA 脅迫能誘導(dǎo)Na+K+-ATPase 和Ca2+Mg2+-ATPase 酶活性出現(xiàn)相似的變化規(guī)律，即24 h時(shí)酶活性顯著升高，隨后酶活顯著降低。高質(zhì)量濃度PFOA脅迫菌株致使2種ATPase的活性與對(duì)照相比均顯著降低。

圖5 PFOA對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞ATP酶活性的影響Fig.5 Effect of different time and PFOA concentrations on ATPase activitres of strain YAB-1

2.4.3 SOD酶活性

機(jī)體遭受逆境脅迫時(shí)，會(huì)形成大量的活性氧自由基，從而造成氧化損傷。而抗氧化酶的存在可以降低活性氧自由基，抑制膜脂過氧化，維持細(xì)胞正常的生理功能。圖6所示為菌株YAB-1 遭受不同劑量PFOA脅迫時(shí)，SOD抗氧化酶活性隨反應(yīng)時(shí)間的變化情況。由圖6可知：低質(zhì)量濃度PFOA 脅迫能夠引起菌體SOD酶活顯著升高；中等質(zhì)量濃度PFOA能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生大量SOD，被脅迫32 h 時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的SOD酶活性達(dá)最大值，為0.399 2 U/mg；高質(zhì)量濃度PFOA 脅迫菌株會(huì)抑制機(jī)體產(chǎn)生SOD，致使SOD 活性顯著下降。

圖6 PFOA對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞SOD酶活力的影響Fig.6 Effect of PFOA on SOD activity of strain YAB-1

2.4.4 CAT酶活性

CAT酶是抗氧化防御系統(tǒng)中一類重要的酶，能將SOD 酶歧化產(chǎn)生的H2O2分解成為H2O 和O2，從而消除細(xì)胞內(nèi)過剩的活性氧自由基，保護(hù)細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常代謝。圖7所示為PFOA對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞CAT酶活力的影響。由圖7可知：低質(zhì)量濃度PFOA 脅迫誘導(dǎo)菌株YAB-1 細(xì)胞CAT 酶升高，脅迫32 h時(shí)CAT活性達(dá)最大為0.361 9 U/mg；中等質(zhì)量濃度PFOA會(huì)誘導(dǎo)菌株CAT活性緩慢升高，之后趨于平緩，48 h后CAT活性達(dá)最高為0.294 3 U/mg。采用高質(zhì)量濃度PFOA處理菌株，CAT活性與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，培養(yǎng)至48 h時(shí)，菌體CAT活性僅為0.115 4 U/mg，顯著低于對(duì)照組。

2.4.5 GST酶活性

圖7 PFOA對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞CAT酶活力的影響Fig.7 Effect of different time and PFOA concentrations on CAT activity of strain YAB-1

作為非酶抗氧化系統(tǒng)一類重要的物質(zhì)GST，也是活性氧自由基重要的清除劑，能保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和酶不被氧化變性，從而維持細(xì)胞體內(nèi)活性氧自由基的動(dòng)態(tài)平衡。圖8所示為菌株YAB-1細(xì)胞從圖8可見：GST在不同質(zhì)量濃度PFOA脅迫下的變化關(guān)系曲線。低質(zhì)量濃度PFOA脅迫能引起菌株YAB-1隨時(shí)間延長(zhǎng)而GST 活性大幅增長(zhǎng)，48 h 時(shí)達(dá)到最大值，GST 活性為0.077 8 U/mg；中等質(zhì)量濃度PFOA能誘導(dǎo)菌株GST活性隨時(shí)間延長(zhǎng)而小幅增長(zhǎng)，48 h時(shí)達(dá)最大值，GST 活性為0.047 3 U/mg。高質(zhì)量濃度PFOA脅迫不能誘導(dǎo)GST活性顯著變化。

圖8 PFOA 對(duì)菌株YAB-1細(xì)胞GST 酶活力的影響Fig.8 Effect of different time and PFOA concentrations on GSH of strain YAB-1

3 討論

3.1 分離株耐受PFOA能力

本研究采用梯度壓力馴化和以PFOA為唯一碳源富集培養(yǎng)，篩選獲得4 株耐受力較強(qiáng)的細(xì)菌。其中，菌株YAB-1 表現(xiàn)出突出的耐受優(yōu)勢(shì)，在1 200 mg/L PFOA 脅迫下仍能生長(zhǎng)。總體來看，4 株菌對(duì)PFOA的耐受性相比薛學(xué)佳等[8]分離的降解菌Z1和Z3更強(qiáng)，也遠(yuǎn)優(yōu)于符安等[15]報(bào)道的釀酒酵母耐受PFOA的能力(＜100 mg/L)。推測(cè)分離菌株來自受氟化物污染的環(huán)境，長(zhǎng)期的選擇壓力導(dǎo)致部分細(xì)菌發(fā)生突變以適應(yīng)新的環(huán)境，耐受能力顯著提高。同時(shí)，開展這些菌株對(duì)PFOA 降解效率的研究，發(fā)現(xiàn)4 株細(xì)菌在優(yōu)化培養(yǎng)條件下PFOA 降解率達(dá)到25%～35%，其中菌株YAB-1的最大降解率為32.4%[16]。

3.2 PFOA脅迫對(duì)耐受菌的細(xì)胞毒性

微生物受到外界脅迫時(shí)，會(huì)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)ROS 含量升高，過量的ROS 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜的過氧化而引起膜氧化損傷。MDA 是細(xì)胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，可用來表征細(xì)胞膜脂過氧化作用能力，揭示細(xì)胞膜損傷程度。本研究中，菌株YAB-1 細(xì)胞內(nèi)的MDA 質(zhì)量摩爾濃度隨PFOA 質(zhì)量濃度的增加而顯著升高。當(dāng)PFOA質(zhì)量濃度升高到1 200 mg/L時(shí)，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體內(nèi)MDA濃度呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢(shì)，這表明污染物脅迫可以增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的積累，引起菌體細(xì)胞膜脂質(zhì)化，MDA 濃度升高。MDA 濃度越高說明細(xì)胞膜損傷越嚴(yán)重，當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間高質(zhì)量濃度脅迫后，細(xì)胞膜損傷，可致菌體破裂解體，MDA 釋放至溶液中，膜上MDA 相對(duì)濃度降低。鄧庭進(jìn)等研究微囊藻毒素對(duì)細(xì)菌中MDA濃度影響時(shí)也證實(shí)了該變化規(guī)律[17]。重金屬脅迫也會(huì)造成MDA 在微生物細(xì)胞質(zhì)膜上積累，從而降低質(zhì)膜的流動(dòng)性，損傷細(xì)胞[18]。

Na+K+-ATPase 和Ca2+Mg2+-ATPase 等ATP 酶 廣 泛存在于細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上，對(duì)維持細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡、離子運(yùn)輸和細(xì)胞膜完整性起著重要作用。當(dāng)中等質(zhì)量濃度PFOA脅迫時(shí)，能誘發(fā)菌株YAB-1 細(xì)胞膜上Na+K+-ATPase 和Ca2+Mg2+-ATPase酶活性顯著升高，在高質(zhì)量濃度PFOA 脅迫下，這2種ATP酶活性顯著降低。脅迫初期菌體通過提高酶的活性來維持細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，當(dāng)ROS 積累過量時(shí)，膜系統(tǒng)完整性受損嚴(yán)重，膜上的ATP酶也受到攻擊，ATP酶活下降，物質(zhì)運(yùn)輸受阻，進(jìn)而使得細(xì)胞凋亡。不同種類的菌株對(duì)PFOA 的響應(yīng)情況不同，楊蒙等[19]研究PFOA 對(duì)大腸桿菌細(xì)胞膜上的Na+K+-ATPase 和Ca2+Mg2+-ATPase 活性發(fā)現(xiàn)，10 mg/L 的PFOA 脅迫36 h 即能誘導(dǎo)ATP 酶活力下降，符安等[15]通過研究PFOA對(duì)酵母菌細(xì)胞膜上ATP酶活性影響得出，100 mg/L PFOA 對(duì)釀酒酵母具有即時(shí)毒性，能使ATP 酶活性降低，致使細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)室篩選的菌株YAB-1 較之有突出的耐受優(yōu)勢(shì)，這與菌株來源于受PFOA 長(zhǎng)期脅迫的環(huán)境有關(guān)。

逆境脅迫誘發(fā)生物體產(chǎn)生的ROS 和SOD 是細(xì)胞對(duì)抗ROS 的第一道防線，能將細(xì)胞內(nèi)過量的O2-歧化為H2O2和H2O，而CAT 則能有效地把H2O2轉(zhuǎn)化成H2O和O2，降低氧自由基的毒性，增強(qiáng)細(xì)菌的耐受性和適應(yīng)性。在本研究中，菌株YAB-1 細(xì)胞SOD 和CAT活性在遭受到低質(zhì)量濃度PFOA脅迫時(shí)與對(duì)照相比顯著增加，在高質(zhì)量濃度PFOA 脅迫時(shí)，SOD 和CAT酶活性均顯著降低。低質(zhì)量濃度PFOA能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生活性氧，從而誘導(dǎo)抗氧化酶濃度升高，高質(zhì)量濃度PFOA長(zhǎng)時(shí)間脅迫會(huì)引起機(jī)體ROS大量積累，機(jī)體不能及時(shí)清除造成氧化損傷，導(dǎo)致酶活性降低。這與王志剛等[20]研究鄰苯二甲酸二甲酯對(duì)典型細(xì)菌Bacillus subtilisB19 和Escherichia coliK12 的氧化損傷所得結(jié)果一致。

機(jī)體內(nèi)GST易與有害物質(zhì)親電結(jié)合，具有解毒作用。菌株YAB-1 在小于900 mg/LPFOA 處理下，刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的GST 與PFOA 或其他中間代謝物結(jié)合，阻止外源化合物與細(xì)胞內(nèi)其他生物大分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)減毒效應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)毒物的耐受性能。隨著PFOA 濃度升高，氧化損傷加劇，細(xì)胞受損甚至凋亡，導(dǎo)致GST活性降低。

4 結(jié)論

1)篩選到4 株以PFOA 為唯一碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，鑒定YAB-1 為類黃色假單胞菌屬(Pseudomonas parafulva)，YAB-2，YAB-3 和YAB-4 分別屬于葡萄球菌屬 (Staphylococcussp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)和蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)。

2)對(duì)分離株進(jìn)行PFOA耐受脅迫分析，發(fā)現(xiàn)低質(zhì)量濃度PFOA脅迫細(xì)菌生長(zhǎng)速度快，在中等質(zhì)量濃度PFOA脅迫下生長(zhǎng)相對(duì)較慢，生物量較低；高質(zhì)量濃度PFOA 抑制菌株增值。菌株YAB-1 表現(xiàn)出較強(qiáng)的PFOA耐受性。

3)優(yōu)勢(shì)耐受菌YAB-1受低質(zhì)量濃度PFOA短期脅迫后，引起細(xì)胞內(nèi)MDA 相對(duì)質(zhì)量摩爾濃度顯著升高，膜上Na+K+-ATP 酶活性與Ca2+Mg2+-ATP 酶活性顯著升高，胞內(nèi)SOD，CAT和GST酶活性顯著升高。當(dāng)高質(zhì)量濃度長(zhǎng)時(shí)脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)MDA濃度顯著降低，膜上Na+K+-ATP 酶活性與Ca2+Mg2+-ATP 酶活性顯著降低，胞內(nèi)SOD和CAT 酶活性顯著降低。