HPLC測定液體制劑中維生素K1含量的方法學(xué)驗證

王亞男

摘 ?要：目的 建立液體制劑中膠束型維生素K1的含量測定方法。方法 采用Ultimate XB-C18色譜柱（5μm，4.6mm×150mm），乙醇：水（9∶1）作為流動相，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為269nm，進(jìn)樣量為20uL。結(jié)果 維生素K1濃度在20.04～200.8ug/mL這之間線性關(guān)系良好。平均回收率為99.95%，RSD為1.05%。結(jié)論 該檢測方法準(zhǔn)確、方便，可以作為液體制劑中維生素K1含量測定的方法。

關(guān)鍵詞：HPLC ?膠束 ?液體制劑 ?維生素K1 ?方法學(xué)驗證

中圖分類號：R927 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1672-3791（2019）07（a）-0251-02

維生素K1主要用于治療體內(nèi)缺少維生素K1從而出現(xiàn)內(nèi)臟等出血現(xiàn)象的病癥，VK1目前基本上藥物應(yīng)用劃分在止血藥物這一領(lǐng)域，臨床上主要以維生素K1注射液的形式給藥[1]。維生素K1不僅治療效果明顯，而且還具有藥價親民等優(yōu)勢。然而維生素K1的溶解性較差限制了它的使用范圍，這一類藥物由于其溶解度都很低從而也導(dǎo)致了其生物利用度在很大程度上大打折扣，從而限制了這一類難溶性藥物在臨床應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展[2]。隨著藥劑學(xué)的不斷發(fā)展，并且通過搜索國外目前市售新型的維生素K1注射液新劑型，我們發(fā)現(xiàn)磷脂膽鹽膠束作為增溶系統(tǒng)中的一種，可以非常明顯地提高該類藥物的水溶性[3]，并且?guī)缀鯇θ梭w不會產(chǎn)生毒副效應(yīng)。膠束型維生素K1注射液在國外臨床上已經(jīng)應(yīng)用多年，是非常優(yōu)良的難溶性藥物的增溶載體。該研究主要就是對磷脂膠束中維生素K1含量測定[4]的高效液相色譜方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，為后期開發(fā)該類產(chǎn)品提供科學(xué)有效的研究依據(jù)。

1 ?材料和儀器

1.1 材料

維生素K1原料藥（山東廣通寶醫(yī)藥有限公司）;蛋黃卵磷脂（含量約為80%，日本丘比株式會社）;膽酸鈉（重慶卡蘭醫(yī)藥有限公司）;鹽酸（德州邁化）;氫氧化鈉（德州邁化）;乙醇（色譜級，F(xiàn)isher）。

1.2 儀器

萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;LC-2010 型高效液相色譜儀（島津，日本）;數(shù)控超聲水浴鍋（江蘇盛藍(lán)儀器公司）;恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （型號：YP-250SDP上海邁捷儀器有限公司）;pH計（型號：STF5000/F，OHAUS/奧豪斯，美國）。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。準(zhǔn)確稱取維生素K1原料藥10.1mg，膽酸鈉54.2mg，磷脂53.9mg，加流動相溶解定容，配制為5.01mg/mL的維生素K1樣品貯備液。

（2）供試品溶液配制。準(zhǔn)確稱取處方量的磷脂及維生素K1，加入適量的三氯甲烷溶解，減壓蒸餾，蒸干成膜后，緩慢加入適量注射用水，震蕩溶解，水浴超聲45min。將超聲后的溶液過濾，去濾液，即得維生素K1磷脂膽鹽膠束溶液。

2.2 含量測定方法學(xué)驗證

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB-C18色譜柱（5μm， 4.6mm×150mm）;流動相：乙醇∶水（9∶1）;檢測波長：269nm;柱溫：30℃;流速：1.0mL·min-1;進(jìn)樣量：20uL。并且以上HPLC條件，理論塔板數(shù)用維生素K1計要不小于2000，另外，藥物與相鄰雜質(zhì)之間的分離度要符合要求。

2.2.2 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取維生素K1待測溶液，按照2.2.1項下的含量測定方法用高效液相色譜儀進(jìn)樣測定，實(shí)驗結(jié)果說明該流動相乙醇∶水（9∶1）下的峰型對稱度良好，且與雜質(zhì)和溶劑在這個系統(tǒng)條件下的分離度較優(yōu)。

2.2.3 空白輔料干擾實(shí)驗

準(zhǔn)確稱取磷脂和膽酸鈉，即空白輔料，加入乙醇稀釋定容，作為輔料溶液，配制成與樣品測定濃度相同的空白輔料溶液，分別按照2.2.1項下的含量測定方法進(jìn)樣測定，經(jīng)過檢測結(jié)果圖譜對比，可見輔料在維生素K1主峰位置處以及周圍無色譜峰，因此輔料對維生素K1主藥的測定沒有干擾。

2.2.4 線性試驗

準(zhǔn)確稱取維生素K1原料藥10.1mg，甘氨膽酸鈉54.2mg，磷脂53.9mg，加流動相溶解定容，配制為5.01mg/mL的維生素K1樣品貯備液。精密量取上述溶液，加乙醇將維生素K1貯備液分別定量作20.04ug/mL，60.03ug/mL，80.02ug/mL，101.3ug/mL，120.9ug/mL，141.4ug/mL，200.8ug/mL，一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在上述HPLC方法條件下測定，對主峰面積A和濃度C用Excel軟件計算，從而計算結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

得出實(shí)驗結(jié)果：維生素K1的濃度在20.04～200.8ug·mL-1范圍時的線性方程為A=210149C-13064，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，由此得出結(jié)論，進(jìn)樣量在20uL時，維生素K1濃度范圍在20.04～200.8mg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確稱取維生素K1原料藥，依法配制成測試濃度的80%、100%、120%3個不同濃度的溶液作為待測溶液，3個濃度溶液各配制3份;另依照上述方法配置3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，共計9份溶液。取上述供試品溶液和對照品溶液分別進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖，計算實(shí)驗結(jié)果。

得出實(shí)驗結(jié)果：在3個不同濃度下的回收率分別都在98.0%～102.0%之間，計算得出的平均回收率是100.01%，RSD%是0.18%，說明該實(shí)驗所采用的方法具有良好的回收率，準(zhǔn)確度符合規(guī)定。

2.2.6 定量限和檢測限

準(zhǔn)確稱取維生素K1，用乙醇溶解維生素K1稀釋制成100mg/mL溶液，作為檢測限和定量限測定時備用的貯備液。分別對上述溶液用乙醇稀釋，進(jìn)樣檢測，當(dāng)S/N約10時測定結(jié)果定為定量限，定量限濃度為120ng·mL-1，連續(xù)進(jìn)樣6針;當(dāng)S/N約3時，結(jié)果得到的檢測限濃度為20ng/mL。

試驗結(jié)果：定量限連續(xù)6針的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)差1.01%，小于2.0%，符合試驗的要求，檢測限為0.4ng，說明該方法的檢測靈敏度較高。

2.2.7 精密度

（1）檢測儀器精密度。取VK1對照品溶液100ug/mL，取該樣品進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)樣6針，進(jìn)行含量測定并計算，結(jié)果表明：平均峰面積計算得出的結(jié)果是2592423.7，RSD是0.19%，其結(jié)果RSD<2.0%，說明該方法的進(jìn)樣精密度好。

（2）重復(fù)性。準(zhǔn)確稱得維生素K1，用乙醇稀釋溶解定容，配制對照品6份，同時配置供試品6份，按照上述方法進(jìn)行試驗，結(jié)果表明：經(jīng)考察后，供試品的平均含量為99.59%，測得RSD為0.73%，符合要求的RSD小于2.0%，說明該實(shí)驗方法的中間精密度良好。

2.2.8 溶液穩(wěn)定性

準(zhǔn)確稱取維生素K1，用乙醇稀釋定容，制備待測貯備液。取維生素K1貯備液，配置成100ug/mL的供試品溶液，分別于第0、2、4、6、8h，測定供試品溶液的含量，考察維生素K1混合膠束溶液的穩(wěn)定性。由以上結(jié)果可知：維生素K1混合膠束溶液在室溫條件下放置8h均穩(wěn)定，滿足穩(wěn)定性實(shí)驗測定的要求。

3 ?結(jié)語

綜合上述實(shí)驗結(jié)果表明：空白輔料對維生素K1膠束型液體制劑的含量測定無干擾;測得線性、精密度（其中包括重復(fù)性和中間精密度）、定量限、檢測限、回收率均符合方法要求，并且溶液在室溫條件下放置8h，測定后的結(jié)果均穩(wěn)定。因此，該方法可以應(yīng)用于維生素K1膠束型液體制劑中維生素K1的含量測定，為后期維生素K1注射液新劑型（磷脂膽鹽膠束）的研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 孟新芳，曹永孝，劉海靜.對維生素K1注射液不良反應(yīng)的思考[J].學(xué)爭鳴，2012（6）：44-46.

[2] 張勇，陳玉威，高桂花.HPLC法測定多維元素片（29）中維生素K1的含量[J].實(shí)用藥物與臨床，2007，10（3）：189-190.

[3] 姜瑞清，周琳，胡桂林，等.對GB 5413.10-2010中維生素K1檢測的改進(jìn)研究[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（9）：50-52.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2015年版）（四部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：623-625.