益氣化瘀口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

徐 智，張友志，郭昌洪，易生福

1.湖北省荊州市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科(荊州 434010)；2.湖北省荊州市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心(荊州 434010)； 3.湖北中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校實(shí)驗(yàn)中心(荊州 434020)

益氣化瘀口服液系由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、丹參、山楂、牛膝、葛根、紅花等十六味中藥組成的復(fù)方制劑，是我院已故著名老中醫(yī)劉云鵬主任醫(yī)師(1910-2013)自用養(yǎng)生秘方，其80歲時(shí)貢獻(xiàn)于醫(yī)院，經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)加工制作而成，具有益氣活血化瘀之功效。治療高脂血癥45例，總有效率91.1%；治療高黏稠血癥108例，總有效率100%；明顯降低血清中同型半胱氨酸(HCY)水平，從而降低缺血性腦卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。取得醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)批準(zhǔn)文號(hào)(鄂藥制字Z20180696)，院內(nèi)臨床使用多年，患者反響良好。益氣化瘀口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)當(dāng)歸和丹參進(jìn)行薄層鑒別，為了更好制定本制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，提高藥品安全性、穩(wěn)定性，讓患者放心服用本藥品，本研究在原薄層鑒別的基礎(chǔ)上增加了黃芪的薄層鑒別，并采用高效液相色譜--蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(HPLC--ELSD) 法對(duì)方中君藥的主要化學(xué)成分-黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定。以期為益氣化瘀口服液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

材料和方法

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Waters1525高效液相色譜儀；Alltech ELSD-2000 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；METKER AE240電子分析天平；N2000色譜工作站；SP-30E型全自動(dòng)薄層色譜點(diǎn)樣儀；GoodLook-1000型-全自動(dòng)薄層色譜成像系統(tǒng)；ICH 110型恒溫箱；KH5200V型超聲波清洗器；D24UV型超純水器。

1.2 試藥：黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：0781-201711)、黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)：140991-201707)、當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)：151311-201801)、丹參對(duì)照藥材(批號(hào)：131312-201704)，均來(lái)自中國(guó)食品藥品檢定研究院(NIFDC)，甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑都為分析純。益氣化瘀口服液由荊州市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心提供，(批號(hào)：20180425、20180814、20181019，規(guī)格10ml/支)。

2 薄層鑒別

2.1 當(dāng)歸：取益氣化瘀口服液30 ml，正丁醇提取3次，每次50 ml，加入正丁醇后用1%氫氧化鈉溶液洗滌3次，每次30 ml，用正丁醇洗至中性。向正丁醇蒸干后的殘?jiān)屑尤爰状? ml溶解，作為供試品。取除當(dāng)歸外的其他成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性對(duì)照組溶液。將1 g當(dāng)歸對(duì)照藥材加入30 ml甲醇，加熱回流1 h，冷卻后過(guò)濾、蒸干，殘?jiān)屑铀?0 ml使之溶解。同法制備對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》的薄層色譜法，吸取上述溶液各5 μl，點(diǎn)于硅膠G薄層板(10×20 cm)上，用氯仿-甲醇-水混合液(13∶6∶2)的下層溶液作為展開(kāi)劑[4-5]，取出、晾干。噴10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰為止。見(jiàn)圖1。

1：當(dāng)歸陰性對(duì)照品；2：當(dāng)歸對(duì)照品；3：當(dāng)歸供試樣品；4：當(dāng)歸對(duì)照藥材

圖1當(dāng)歸TLC圖譜

2.2 丹參：取益氣化瘀口服液15 ml，用三氯甲烷提取2次，每次15 ml，合并提取液，蒸干后加1 ml甲醇于殘?jiān)?，作為供試品溶液。取除丹參以外的其他成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性?duì)照組溶液。取將1 g丹參對(duì)照藥材加入30 ml水，加熱回流1 h，冷卻后過(guò)濾、蒸干，殘?jiān)屑? ml乙醇使之溶解。同法制備對(duì)照品溶液。按照《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》的薄層色譜法，吸取上述溶液各5μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板(10×20cm)上，用環(huán)乙烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙肝混合液(3∶3.5∶1.5∶0.5∶1)的下層溶液作為展開(kāi)劑[4-6]，置于展開(kāi)缸，預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出并晾干，365 mm紫外燈下檢視。見(jiàn)圖2。

1：丹參陰性對(duì)照品；2：丹參對(duì)照品；3：丹參供試樣品；4：丹參對(duì)照藥材

圖2丹參TLC圖譜

2.3 黃芪：取益氣化瘀口服液30 ml，加入稀鹽酸調(diào)整pH值至2。采用醋酸乙酯震蕩提取3次，每次50 ml，隨后水浴蒸干，向殘?jiān)屑尤爰状? ml使之溶解，作為供品溶液。取除黃芪以外的其它成分，按照供試品溶液制備工藝和前期處理方法，制備陰性對(duì)照組溶液。將1 g黃芪對(duì)照藥材加入乙酸乙酯-甲醇混合液(3∶1)60 ml中[4,7]，加熱回流30 min，過(guò)濾，蒸干，向殘?jiān)屑尤爰状? ml使之溶解，將上清液作為對(duì)照藥材溶液。取黃芪苷為對(duì)照品，參照《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[8]的薄層色譜法，吸取上述溶液各1 μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板(10×20 cm)上，用醋酸丁酯-甲酸-水混合液(7∶4∶3)的上清液為展開(kāi)劑，展開(kāi)后取出，晾干。噴2%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰為止。見(jiàn)圖3。

1：黃芪陰性對(duì)照品；2：黃芪對(duì)照品；3：黃芪供試樣品；4：黃芪對(duì)照藥材

圖3黃芪TLC圖譜

3 含量測(cè)定

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；Thermo色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)以乙晴-水(30∶70)溶液為流動(dòng)相，流速為1 ml/min[9-10]。柱溫設(shè)置為30℃，檢測(cè)時(shí)波長(zhǎng)設(shè)置為276 nm。蒸發(fā)光檢測(cè)器溫度設(shè)置為70℃，氣流2 L/min、增益2。理論塔板數(shù)按照黃芪甲苷峰計(jì)算≥4000。色譜圖如圖4。

圖4 黃芪甲苷的HPLC色譜圖

3.2 對(duì)照品溶液的制備：取黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品6.25 mg，將其置于25 ml容量瓶中，加入甲醇定容，濃度為250 μg/ml，將其作為母液。取母液1.25 ml、2.5 ml、3.75 ml、5 ml、6.25 ml、7.5 ml分別置于25 ml容量瓶，用甲醇溶解作為對(duì)照品。

3.3 供試品溶液的制備：取益氣化瘀口服液，搖勻，過(guò)濾，精密量取20 ml，置100 ml 分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，20 ml/次 , 棄去三氯甲烷[8], 水層再用水飽和的正丁醇萃取4次(30、30、20、20 ml), 最后1次水放凈,合并4次正丁醇萃取液, 用氨試液洗滌2次(每次5 ml );棄去氨試液,繼續(xù)用正丁醇飽和水溶液洗至中性,棄去水液。取正丁醇溶液蒸干,殘?jiān)铀?0 ml ,使其溶解通過(guò)D101型大孔吸附樹(shù)脂柱(內(nèi)徑1.0 cm ,長(zhǎng)15 cm),依次用水50 ml、40 %乙醇50 ml、70 %乙醇50 ml洗脫 ,收集70 %乙醇洗脫液,蒸干,精密加入甲醇(色譜純)10 ml使其溶解, 定容,作為供試品溶液[11-13]。

3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備：按照益氣化瘀口服液原方組成及制備方法，按“3.3”項(xiàng)下方法制備不含黃芪的陰性樣品溶液。

結(jié) 果

1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取黃芪甲苷(C=0.25 mg/ml)對(duì)照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，注入色譜儀中，測(cè)定峰面積?；貧w方程：Y=1.74X-156.61，r=0.9996(n=6)表明黃芪甲苷在0.120～0.745 μg范圍具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取由益氣化瘀口服液制成的供試品溶液10 μl，分別于1、2、4、8、12、24 h測(cè)定黃芪甲苷含量，結(jié)果RSD%為0.52%，說(shuō)明24 h內(nèi)其穩(wěn)定性良好。

3 精密度試驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)品(0.25 mg/m)10μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，計(jì)算RSD%為1.48%。

4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)：20180814)分成6份樣品溶液，按“3.1”色譜條件測(cè)定其峰面積。結(jié)果RSD%為2.66%。

5 回收率試驗(yàn) 精密量取樣品6份，每份(0.25 mg/ml)1 ml，置于25 ml容量瓶，加入益氣化瘀口服液4 ml，按照益氣化瘀口服液供試品制備，上樣10μL，按“3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率，平均值為96%，RSD%為1.45%(n=6)。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

6 含量測(cè)定 取不同批次益氣化瘀口服液按上述方法測(cè)定黃芪甲苷的含量，3批樣品測(cè)量，見(jiàn)表2。

表2 三批黃芪甲苷含量檢測(cè)結(jié)果

討 論

益氣化瘀口服液方中重用味甘性溫的黃芪，入脾肺二經(jīng)，可大補(bǔ)元?dú)猓嫘l(wèi)升陽(yáng)，祛瘀而不傷正，是為君藥，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗衰老、增強(qiáng)代謝、降壓、保護(hù)心功能、免疫調(diào)節(jié)等作用。醫(yī)院以前的審定鑒別標(biāo)準(zhǔn)中，只對(duì)方中當(dāng)歸、丹參進(jìn)行薄層鑒別，本研究在此基礎(chǔ)上增加了黃芪的薄層色譜鑒別，多項(xiàng)薄層鑒別保證定性鑒別結(jié)果更準(zhǔn)確，在薄層的基礎(chǔ)上，本研究緊跟現(xiàn)代制藥技術(shù)，參考相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)方中16味中藥的理化性質(zhì)進(jìn)行理論分析，確定了對(duì)方中黃芪的主要化學(xué)成分黃芪甲苷進(jìn)行了含量測(cè)定。依據(jù)《中國(guó)藥典》2015版要求，對(duì)中藥制劑需進(jìn)行定量分析，從院內(nèi)自制制劑長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展的角度，須提升院內(nèi)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。黃芪為益氣化瘀口服液方中的君藥，經(jīng)現(xiàn)代藥理研究證明，其主要核心成分是黃芪甲苷。目前對(duì)黃芪甲苷含量測(cè)定的方法有薄層色譜掃描法、UV-HPLC法和ELSD-HPLC法。但黃芪甲苷僅在200nm紫外區(qū)有末端吸收，故用UV-HPLC 法干擾很大。而蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為通用型檢測(cè)器，適用于無(wú)紫外末端吸收皂苷類(lèi)化合物，它具有分辨率高, 重復(fù)性好 , 簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。