黃芪多糖對游離脂肪酸所致人血管內皮細胞NLRP3炎性小體表達的影響

姜 帥

遼寧省錦州市中心醫(yī)院心內科(錦州 121000)

黃芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是由黃芪的根經提取得到。黃芪多糖提取物中含有多種組分,包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖，是一種具有多種藥理作用的天然藥材。近年來，黃芪多糖的抗炎、抗氧化、調控免疫力、抗腫瘤等能力備受研究者的關注[1-2]。這對于中藥活性研究及中藥現(xiàn)代化也起到一定的推動作用。炎癥是血管中活性物質對病灶部位所進行的抵抗反應。血管內膜完整性是維持內環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，炎癥、高血壓、心血管疾病等會引起內皮損傷從而誘發(fā)其他疾病的發(fā)生[3]。炎癥小體是多種蛋白質組成的復合體，在機體免疫反應與疾病發(fā)生過程中具有重要的作用[4]。炎癥小體的激活可以直接導致白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(Interleukin -18,IL-18)等炎癥因子的釋放[5]。目前發(fā)現(xiàn)的炎癥小體有3種，即核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1)、核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)、黑色素瘤-2(Absent in melanoma-2，AIM2)[6]。NLRP3是近年來研究較多的一種模式識別受體，它是由NLRP3、半胱氨酸蛋白酶Caspase-1、凋亡相關斑點樣蛋白構成[7]。胞內各種危險信號都可激活NLRP3，導致Caspase-1剪切成分子量更小的Caspase-1 P10片段，從而使得下游的IL-1β和IL-18等炎癥因子產生[8-9]，最后導致心血管疾病的病變和發(fā)展。還有研究表明脂質尤其是飽和脂肪酸沉積可引起 NLRP3 炎性小體相關基因表達升高，促進局部炎癥反應[10]。

黃芪多糖具有抗炎、抗氧化、降脂和免疫調節(jié)等生物學活性，且不易殘留、副作用小、毒性低。在細胞層面、分子層面上具有一定的抑制炎癥反應的能力。有研究證明黃芪多糖可以降低糖尿病大鼠游離脂肪酸的水平，其可能的機制是黃芪多糖通過非胰島素通路活化腺苷酸激活蛋白激酶[Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)]通路[11-12]。還有研究者認為黃芪多糖降低細胞 TLR4/ NF-KB mRNA 表達，下游炎癥因子含量降低，在一定程度可緩解細胞損傷，其機制可能是通過抑制TLR4/ NF-KB通路，調節(jié)炎癥反應而發(fā)揮抗炎作用[13-14]。但是很少有人研究黃芪多糖是否通過抑制NLRP3炎癥小體通路進行炎癥的抑制反應，包括抑制Caspase-1活性片段的生成，以及減少IL-1β等炎癥因子的產生，從而抑制HUVECs炎癥反應的產生，因此本研究探討黃芪多糖抑制炎癥的相關機制，驗證NLRP3炎癥小體是否參與該抑炎過程。

材料和方法

1 材 料

1.1 實驗試劑：ECM培養(yǎng)基以及胰蛋白酶購自Gibico。胎牛血清和PBS緩沖液(0.01M)購自以色列BI公司。 Caspase-1抑制劑YVAD、甘氨酸、Tris-base、SDS、脫脂奶粉、牛血清白蛋白BSA、長鏈游離脂肪酸(油酸∶軟脂酸=2∶1)購自美國Sigma公司。NLRP3 siRNA轉染試劑盒購自美國羅氏公司。BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo。RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、ECL發(fā)光染色劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。蛋白酶抑制劑、三酰甘油測試試劑盒和游離脂肪酸試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。SDS上樣緩沖液、丙烯酰胺、硝酸纖維素膜購自安布雷拉公司。NOX4、NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗購自美國 Abcam，熒光二抗抗體抗體購自CST。

2 研究方法

2.1 細胞培養(yǎng)：人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)購于美國ATCC中心。用含1%內皮細胞生長補充劑、5%胎牛血清、1%雙抗的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合度達90%以上后，胰酶消化細胞，胎牛血清終止消化，以1∶2或1∶3比例進行傳代。

2.2 實驗分組及其干預：時間梯度刺激實驗即分組包括陰性對照組、游離脂肪酸組、4組時間梯度APS組(3、6、12、24 h)。5%胎牛血清的ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVEC細胞。除陰性對照組，其他各組加入長鏈游離脂肪酸 0.25 mmol/L預處理。然后改用不含血清的ECM進行培養(yǎng)，饑餓24 h。其他時間組在不同時間點加入200 mg/L、APS 200 μl，充分混勻，篩選出適合的時間用于NLRP3干擾和Caspase-1阻斷實驗。

2.3 濃度梯度刺激實驗：分組包括陰性對照組、游離脂肪酸組、4組濃度梯度APS組(50 mg/L組、100 mg/L組、200 mg/L組、400 mg/L組)。除陰性對照組外，其他各組加入長鏈游離脂肪酸 0.25 mmol/L預處理。細胞饑餓24 h后，其他各組分別加入不同濃度黃芪多糖 200 μl，充分混勻，刺激12 h，篩選出適合的濃度用于NLRP3干擾實驗和Caspase-1阻斷實驗。

2.4 抑制NLRP3基因表達實驗：分組包括陰性siRNA組(Scramble)、陰性siRNA 加 APS組、抑制NLRP3 siRNA組、抑制NLRP3 siRNA 加APS組，共四組。各組先用游離的脂肪酸預處理12 h，無血清ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞饑餓24 h。各組分別加入相應的RNA轉染，其中Scramble siRNA + APS組、NLRP3 siRNA+APS組加入200 mg/L 黃芪多糖 200 μl，共孵育12 h。

2.5 抑制Caspase-1表達實驗：分組包括陰性對照組、APS組、Caspase-1抑制劑YVAD組、APS + YVAD組，共四組。各組先用游離脂肪酸預處理。細胞饑餓24 h后，在YVAD組、APS+YVAD組加入20 μl YVAD(4×10-5mol/L)預處理1 h。然后在APS組、APS + YVAD組，加入200 mg/L APS 200 μl，充分混勻，刺激12 h。

3 三酰甘油含量測定 采用三酰甘油試劑盒檢測三酰甘油含量[15]。APS 200 mg/L刺激內皮細胞12 h，PBS沖洗3次，加入提取液(緩血酸胺20 mmol/L，硫酸鎂4 mmol/L，氯化鈉80 mmol/L，葡萄糖20 mmol/L，乙二胺四乙酸5 mmol/L， 二硫蘇糖醇2 mmol/L，pH值7.4)1 ml， 加入氯仿-甲醇2 ml(體積比2∶1)，勻漿2 min，室溫攪拌混勻30 min，室溫下3000 rpm 離心10 min(離心半徑13.5 cm)，用氯仿-甲醇2 ml再次抽提后，取2次抽提的氯仿-甲醇于35℃真空抽干,50 μl異丙醇復溶，用三酰甘油試劑盒進行檢測。

4 游離脂肪酸含量測定 游離脂肪酸檢測試劑盒檢測游離脂肪酸。APS 200 mg/L刺激內皮細胞12 h，PBS洗滌3次，然后超聲破碎細胞，每次 5～10 s，進行20次，1300 rpm離心10 min，上清液備用。 采用乙酰輔酶A合成酶-乙酰輔酶A氧化酶法測定。在上清液10 μl中加入400 μl發(fā)色試劑A；5 min后，加入200 μl發(fā)色劑B；10 min后，測定546 nm和660 nm吸光度。 游離脂肪酸濃度測定由全自動生化儀完成。

5 免疫印跡試驗(Western blot)檢測 蛋白表達 NLRP3、NOX4、Caspase-1 以及 IL-1β蛋白的表達水平通過免疫印跡試驗檢測。具體步驟如下：在刺激時間結束后，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入適量的含有蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液裂解細胞，用細胞刮迅速刮起細胞碎片，離心后上清就是裂解得到的蛋白質，BCA試劑盒檢測蛋白質濃度。稀釋成合適的上樣濃度，加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min使得蛋白變性[16]。SDS-PAGE電泳法分離不同相對分子質量的蛋白質。將電泳分離后的蛋白在4℃條件下電轉移至硝酸纖維素膜。加入7%的脫脂奶粉或2% BSA蛋白溶液的封閉液孵育條帶膜，置于搖床上室溫孵育，封閉1 h。TBST搖床洗3次，每次5 min。加入用TBST稀釋比例為1∶5000的NOX4、NLRP3、Caspase-1 和 IL-1β一抗，于搖床上室溫孵育1 h。TBST搖床洗3次，每次5 min。加入用TBST稀釋比例為1∶10000的熒光二抗，于搖床上避光孵育1 h。TBST搖床避光洗3次，每次5 min。用濾紙在膜周圍吸水后，加入少量的ECL染色劑染色，放入熒光掃描儀暗室內掃描，得到蛋白條帶圖片。用Image-J軟件對圖片進行灰度分析，以β-actin為參比蛋白。

6 ELISA法測試上清細胞因子 利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測試陰性對照組、游離脂肪酸、游離脂肪酸與APS組與HUVEC細胞共孵育12 h后細胞上清的炎癥細胞因子TNF-α、IL-8和IL-18。

7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件對所有數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據都以均數(shù)±標準差表示，各組間的對比采用單因素方差分析及t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 適合的刺激濃度與時間篩選 表1結果顯示隨著時間的延長，APS對游離脂肪酸的清除成正比，但是在12～24 h清除效果基本不變，所以篩選出黃芪多糖適合的刺激時間在12 h。

表2結果顯示隨著APS濃度的增高，游離脂肪酸清除效果也呈濃度依賴性增高，而在200～400 mg/L的清除效果達到平臺期，所以篩選出APS適合的濃度在200 mg/L。綜上在200 mg/L濃度下刺激12 h達到最好的清除游離脂肪酸的效果，與游離脂肪酸對照組有統(tǒng)計學的差異(P<0.05)，用于后續(xù)的NLRP3干擾實驗和Caspase-1阻斷實驗。

表1 各組不同時間梯度刺激后游離脂肪酸的濃度(μmol/L)

表2 各組不同濃度梯度刺激后游離脂肪酸的濃度(μmol/L)

2 三酰甘油及游離脂肪酸含量測定 與對照組比較，APS組三酰甘油及游離脂肪酸含量差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)，游離脂肪酸組中三酰甘油及游離脂肪酸含量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。與游離脂肪酸組比較，游離脂肪酸加APS組三酰甘油及游離脂肪酸含量均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

3 各組蛋白及細胞因子表達情況 游離脂肪酸組與陰性對照組對比，NOX4、NLRP3、Caspase-1 和IL-1β都明顯升高，與游離脂肪酸組比較，APS組各種蛋白表達均有不同程度的降低。隨著時間的增加，蛋白表達在降低，但在12～24 h的降低不是很明顯，見圖1。且這四種蛋白中，NLRP3變化最為顯著。隨著黃芪多糖濃度的升高，各個蛋白表達在降低，變化率最大的也是NLRP3蛋白,且在黃芪多糖200 mg/L、400 mg/L濃度下，各個蛋白與游離脂肪組相比均有明顯的降低，有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，見圖2。

表3 各組APS刺激12 h后三酰甘油與游離脂肪酸濃度

NLRP3基因干擾實驗及Caspase-1阻斷實驗情況見圖3、圖4。進一步觀察APS對這兩種基因的影響。游離脂肪酸在處理后，NLRP3沉默基因會使NLRP3蛋白表達量顯著降低(P<0.01)，而單獨APS的作用與沉默基因的效果相似(P<0.01)。且相對于APS以及NLRP3沉默基因單獨作用，兩者共同作用下，NLRP蛋白表達降低更多。Caspase-1阻斷實驗也是相似的結果。在Caspase-1抑制劑YVAD作用下，Caspase-1顯著降低(P<0.01)。單獨APS作用下Caspase-1也顯著降低(P<0.01)。且相對于各自單獨作用，在YVAD與APS共同作用下，Caspase-1蛋白表達降低更多。由此可見APS可通過抑制NLRP3、Caspase-1表達，阻斷下游炎癥通路，抑制IL-1β炎癥因子產生，抑制細胞凋亡。同時還用ELISA方法測試了炎癥因子TNF-α、IL-8及IL-18，APS相對于游離脂肪酸組顯著降低了這些炎癥因子的表達。

圖1 不同時間梯度刺激后Western blot測試各個蛋白表達情況(A)及其定量(B)

圖2 不同濃度梯度刺激后Western blot測試各個蛋白表達情況(A)及其定量(B)

圖3 NLRP3沉默基因刺激后Western blot測試各個蛋白表達情況(A)及其定量(B)

圖4 Caspase-1抑制劑YVAD刺激后Western blot測試蛋白表達情況(A)及其定量(B)

討 論

免疫炎癥是引發(fā)心血管疾病的重要因素，它能使心血管疾病從早期無癥狀階段發(fā)展到損傷狀態(tài)以及具有明顯功能障礙的高級階段，其主要表現(xiàn)為內皮細胞功能障礙、動脈粥樣硬化、血管壁病變等[17]。因此，深入研究血管內皮炎癥的機制具有重要意義，可為心血管疾病的預防、治療及預后提供有力的依據。具體來說，血管內皮炎癥反應包括促炎因子和粘附因子的表達，以及后續(xù)的脂質過氧化及細胞遷移等不良表現(xiàn)。有研究者通過大鼠的燙傷模型，檢測不同時間段的血清中炎癥因子表達水平的改變，發(fā)現(xiàn)APS對IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 多種炎癥因子的表達具有抑制作用，表明APS可以抑制燙傷引起的炎癥反應[18]。人體主要的炎癥細胞有淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等，TNF-α與IL-8是主要的炎性因子，TNF-α是主要由單核巨噬細胞在細菌、病毒感染時釋放的生物活性物質，會促進中性粒細胞脫顆粒、蛋白水解酶釋放，介導炎癥反應[19]。IL-8也由單核巨噬細胞產生，主要活性是招募和激活中性粒細胞，誘導大量氧自由基、花生四烯酸等炎癥介質釋放而加重炎癥[20]。因此我們同時檢測了炎癥因子TNF-α與IL-8的表達情況，結果表明APS組相對于游離脂肪酸組顯著降低了這兩種炎性因子的表達，佐證了APS的抗炎作用。

當血管內皮細胞啟動炎癥反應，包括氧化應激狀態(tài)下引起炎癥，都可能導致血管內皮功能被破壞。炎癥小體是一種多蛋白復合體，在機體免疫反應與疾病發(fā)生過程中具有關鍵的作用，NLRP3炎癥小體的機制被研究得最多、最全面[21]。NLRP3會感受細胞內的危險信號，尤其是細胞內受到刺激后大量生成的活性氧?；钚匝蹩梢约せ頝LRP3炎癥小體從而誘導IL-1β、IL-18等炎癥因子的表達[22]。NLRP3炎癥小體具體是如何參與到血管內皮炎癥的過程還沒有研究透徹。本研究發(fā)現(xiàn)200 mg/L黃芪多糖與游離脂肪酸共培養(yǎng)12 h后，HUVECs的NLRP3相對應的 NLRP3 和 Caspase-1 表達都有明顯下調，伴隨著NOX4蛋白表達降低，同時也減少了NLRP3底物IL-1β剪切的具有炎癥活性的IL-1β P17片段，說明抑制了NLRP3炎癥小體通路。本研究還采用NLRP3沉默基因 siRNA及Caspase-1抑制劑YVAD抑制NLRP3炎癥小體的作用，探究炎癥反應是否與NLRP3炎癥小體的作用有關系。同時隨著NLRP3炎癥小體功能的阻斷，下游的促炎物質IL-1β P17顯著減少。此外，研究還發(fā)現(xiàn)NLRP3蛋白在si RNA抑制以后，NOX4蛋白的表達也明顯降低，這個結果表明NLRP3和NOX4之間可能存在著一種相互影響的作用，而YVAD對NOX4蛋白的表達影響幾乎沒有改變。黃芪多糖的作用與NLRP3沉默基因 siRNA及Caspase-1抑制劑YVAD產生了類似的作用效果，可見黃芪多糖可通過抑制NLRP3炎癥小體通路來抑制炎癥，降低炎癥因子的表達，抑制內皮細胞的凋亡，阻止內皮細胞的功能障礙。采用游離脂肪酸導致人血管內皮細胞產生炎癥后，黃芪多糖可通過抑制NLRP3炎癥小體表達，進而抑制Caspase-1生成，降低胞內炎癥介質IL-1β活性片段生成，最終減少血管炎癥的發(fā)生。其較好的抗炎效果對炎癥疾病的治療發(fā)揮著重要的作用。此外，黃芪多糖可提高免疫力、抗氧化、促進血管內皮增生、抑制腫瘤、保肝、調節(jié)血糖、防治腦血管損傷等作用[23-24]，使其具有更廣闊的研究空間?，F(xiàn)代中醫(yī)學領域，對黃芪多糖的研究已達到細胞、分子層面，但是黃芪多糖提高機體抗炎能力的作用機制還未完全清楚，應對其進一步研究。