圣愈湯聯(lián)合放射治療對(duì)人宮頸癌荷瘤小鼠脾臟 DCs 細(xì)胞功能的影響*

孫立哲，李磊強(qiáng)，耿翠翠，張 楊，劉寶剛

陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽(yáng) 712000)

圣愈湯出自清代吳謙編寫的《醫(yī)宗金鑒》,由熟地、白芍、川芍、當(dāng)歸、人參、黃芪組成,是益氣補(bǔ)血的常用方。在臨床中也有不少醫(yī)生用本方來(lái)輔助治療惡性腫瘤,改善患者放療后的機(jī)能狀況，提高免疫力[1]。在腫瘤免疫治療中，樹突狀細(xì)胞(DCs)在其中起著關(guān)鍵的作用 ，DCs能通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞特異性抗原，與T淋巴細(xì)胞結(jié)合并激活 T 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)生成，介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答 ，起到監(jiān)測(cè)、殺滅腫瘤的功能[2-3]。本研究觀察了圣愈湯聯(lián)合放療對(duì)荷瘤小鼠脾臟DCs活性、細(xì)胞因子分泌的影響。

資料和方法

1 材 料 健康6～7周齡雌性昆明種小鼠，體重 18-22 g，購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。 宮頸癌Hela細(xì)胞株購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。圣愈湯生藥飲片 (熟地黃、 白芍、當(dāng)歸、川芎、人參、黃芪)購(gòu)于仁和大藥房，按人參 (用生曬參)9 g, 黃芪20 g, 熟地、 白芍各 15 g, 當(dāng)歸、 川芎各 10 g 的比例,取中藥浸泡 1 h, 文火煎煮約 1 h, 過(guò)濾并濃縮至生藥 1 g/ml，無(wú)菌分裝, 置于 4 ℃冰箱保存。CD11c、CD86、 MHC-Ⅱ等流式檢測(cè)抗體購(gòu)自eBioscience公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自 R&D 公司，LDH 試劑盒購(gòu)自 Thermo 公司,磁珠分選系統(tǒng)購(gòu)自 BD 公司。放療設(shè)備為大恒公司6MV-X線治療機(jī)。

2 研究方法

2.1 Hela細(xì)胞培養(yǎng)：人宮頸癌Hela細(xì)胞株，購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)。使用含10%小牛血清的髙糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%的CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。使用接種后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

2.2 小鼠宮頸癌模型的建立：取健康昆明種小鼠，復(fù)蘇傳代Hela細(xì)胞株，待Hela細(xì)胞生長(zhǎng)至5×109/ml時(shí)胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化，離心取沉淀，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度。采用細(xì)胞懸液皮下種植法制備荷瘤鼠模型，小鼠雙側(cè)大腿內(nèi)側(cè)皮下接種細(xì)胞懸液0.2 ml(約1×108個(gè)/ml細(xì)胞)，隔天觀察小鼠皮下宮頸癌的成瘤及生長(zhǎng)情況，直至腫瘤大小約為5 mm×5 mm×5 mm，隨機(jī)抽取3只小鼠，取腫瘤組織行HE染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定荷宮頸癌小鼠模型的成功建立。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理：將成功建立的荷瘤小鼠模型隨機(jī)分為對(duì)照組、圣愈湯組、放療組和圣愈湯聯(lián)合放療組，每組10只。對(duì)照組：不做治療。圣愈湯組：以圣愈湯0.4 ml灌胃，連續(xù)給藥2周。放療組：給予6MV-X線局部照射，劑量20Gy/2d，小鼠移植瘤皮膚表面予以凡士林均勻涂抹做劑量補(bǔ)償，其余部位予以鉛擋保護(hù)，源皮距100 cm。圣愈湯聯(lián)合放療組：圣愈湯給藥時(shí)間同圣愈湯組，局部放療時(shí)間同放射組。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟DCs的活化情況：在給藥至14 d時(shí)，取各組小鼠新鮮脾臟組織修剪成5 mm×5 mm×5 mm大小的組織塊，PBS沖洗后，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，在尼龍網(wǎng)上使用5 ml注射器柱塞行機(jī)械研磨，制成勻漿，300 μlPBS混勻；加入3倍體積的紅細(xì)胞裂解液4℃，靜置5 min；低溫離心5 min，倒掉上清液，400μlPBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml；滴加抗體：a管為空白管，不加入任何抗體；b管為同型對(duì)照管，加入c管所加抗體等量的同種屬同型對(duì)照抗體；c管滴加不同巧光素標(biāo)記的CD11c、CD86、MHC-Ⅱ抗體。震蕩器混勻，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，離心，300 g×5 min，棄上清，低溫PBS洗涂?jī)纱?，然?00μlPBS重懸，加入流式管中，4℃避光保存；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)脾臟細(xì)胞IFN-γ的分泌水平：治療 14 d后，取出各組小鼠脾臟，剪碎成1 cm3大小組織塊，研磨組織至勻漿狀，適量生理鹽水沖洗研磨器并收集懸液， 經(jīng)尼龍網(wǎng)過(guò)濾，850轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清，生理鹽水洗滌3次，離心去上清后，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液重懸，制成密度為 1×107/ml細(xì)胞懸液；再次離心取沉淀，按10倍細(xì)胞壓積的比例加入紅細(xì)胞裂解液，混合，靜置5 min后用 PBS沖洗后，以含2%FBS 的保護(hù)液重懸沉淀，加入LC分離液，離心后取中間層細(xì)胞，PBS 洗滌后重懸，使用MACS磁珠分選系統(tǒng)分離出 DCs，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h后收集上清。用ELISA法檢測(cè)上清中的 IFN-γ含量，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，結(jié)果在酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算質(zhì)量濃度，單位是pg/ml。

2.6 LDH實(shí)驗(yàn)檢測(cè)脾臟細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)殺傷活性：無(wú)菌取小鼠脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，并分離CD8+CTLs。以CD8+CTLs為效應(yīng)細(xì)胞，宮頸癌Hela細(xì)胞為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞按20∶1比例混合，接種于培養(yǎng)瓶，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h；PBS重懸細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液 4℃低溫裂解 5 min，12 000轉(zhuǎn)/min離心3 min， 取上清為細(xì)胞裂解產(chǎn)物。使用LDH 試劑盒檢測(cè)CD8+CTLs 殺傷活性 ；細(xì)胞殺傷活性計(jì)算；殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)/(最大釋放組A值-靶細(xì)胞自然釋放組A值)×100%。

結(jié) 果

1 各組小鼠脾臟DCs活化情況 小鼠經(jīng)圣愈湯灌胃第7天時(shí)，圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對(duì)照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高(P<0.05),見表1。

表1 脾臟DCs活化情況流式細(xì)胞測(cè)定結(jié)果

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

2 各組小鼠細(xì)胞因子分泌水平 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量均較對(duì)照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組INF-γ分泌量與其余各組比較更高(P<0.05),見表2。

3 圣愈湯聯(lián)合放療可明顯提高脾臟CD8+CTLs殺傷活性 圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷均較對(duì)照組升高(P<0.05),且圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟CD8+CTLs殺傷與其余各組比較更高(P<0.05)，見表3。

表2 各組小鼠細(xì)胞因子分泌水平

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

表3 各組小鼠CD8+CTLs殺傷活性檢測(cè)結(jié)果(%)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；組間比較， #P<0.05

討 論

圣愈湯以補(bǔ)益元?dú)獾娜藚⒑妥剃庰B(yǎng)血的熟地為主藥，輔以黃芪健脾益氣，白芍?jǐn)筷庰B(yǎng)血，當(dāng)歸、川芎補(bǔ)血活血，共奏益氣補(bǔ)血之效[4-5]。有研究表明，圣愈湯能調(diào)整免疫抑制小鼠的T細(xì)胞亞群分布及細(xì)胞因子含量，對(duì)小鼠免疫功能有一定的促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用[6-8]；本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，觀察圣愈湯聯(lián)合放療對(duì)荷宮頸癌小鼠脾臟DCs分泌細(xì)胞因子及CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性的影響，以進(jìn)一步明確圣愈湯的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)理。

樹突狀細(xì)胞(DCs)機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)豐富的MHC分子、共刺激分子及粘附分子，刺激T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)抗原特異性的CTL細(xì)胞生成，從而在腫瘤免疫中起主導(dǎo)作用[9-11]。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)圣愈湯及放療干預(yù)后各組小鼠脾臟的DCs活化情況，結(jié)果表明：圣愈湯組、放療組及圣愈湯聯(lián)合放療組脾臟活化DCs數(shù)量均較對(duì)照組升高,且圣愈湯聯(lián)合放療組活化DCs更高。說(shuō)明圣愈湯促進(jìn)了體內(nèi)DC的分化、成熟，而放療組DCs也出現(xiàn)活化增多，則可能與放療后腫瘤細(xì)胞壞死，抗原物質(zhì)釋放后激活機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)；而圣愈湯聯(lián)合放療后可放大這種腫瘤免疫反應(yīng)。

DCs細(xì)胞活化后，可將抗原提呈給CD4+T細(xì)胞，調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化為Th1/Th2細(xì)胞，其中Th1可通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子(如INF-γ)參與細(xì)胞免疫，具有顯著的抗腫瘤作用；同時(shí)DCs攝取抗原后，可激活CD8+T細(xì)胞，增強(qiáng)CTLs殺傷活性，產(chǎn)生對(duì)宮頸癌特異性的細(xì)胞毒性殺傷作用[12]；本研究結(jié)果表明：圣愈湯及圣愈湯聯(lián)合放療均能增加INF-γ的分泌，并由此促進(jìn)CTLs細(xì)胞的成熟活化，增強(qiáng)CTLs殺傷活性；且提示聯(lián)合治療更有效激活抗原提呈細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫。

綜上所述，圣愈湯可促進(jìn)荷瘤小鼠脾DC的分化、成熟，增加INF-γ分泌，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向CTLs的分化，增強(qiáng)CTLs殺傷活性，進(jìn)而提高小鼠抗腫瘤免疫；并且圣愈湯聯(lián)合放療后，可放大其免疫促進(jìn)作用；而這種免疫增強(qiáng)作用是否持久，能否達(dá)到穩(wěn)定的治療效果，則還需進(jìn)一步的研究。