當(dāng)歸拈痛湯對(duì)高尿酸血癥性腎病小鼠腎臟保護(hù)作用的研究*

李宇軒，李 笑，于學(xué)成，宋 林，張嘯林，楊 昊，邵雨萌

山東中醫(yī)藥大學(xué)(濟(jì)南250355)

高尿酸血癥性腎病是由腎臟排泄尿酸過少或長期嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸升高，尿酸在血中過飽和而沉積于腎臟組織導(dǎo)致的腎損害。近年來由于人民飲食習(xí)慣的改變，高尿酸血癥性腎病患者數(shù)量持續(xù)上升[1]。當(dāng)前治療高尿酸血癥性腎病使用比較廣泛的治療藥物包括抑制尿酸生成和促尿酸排泄藥物兩大類：選用藥物如苯溴馬隆、秋水仙堿等，但以上藥物對(duì)肝腎功能的損傷不容忽視，停藥后易反復(fù)[2]。高尿酸血癥性腎病根據(jù)中醫(yī)理論，其發(fā)病機(jī)制為患者先天稟賦不足或飲食不節(jié)致脾胃失和、恣欲損及腎元，先天之本俱傷而致腎失溫化、脾失健運(yùn)，進(jìn)而津液運(yùn)化失常、痰飲內(nèi)停，濕熱下注。痰濕阻滯氣機(jī)，濕熱濁邪，病涉血分[3]。當(dāng)歸拈痛湯載于《醫(yī)學(xué)啟源》，為金元時(shí)期所創(chuàng)千古名方，全方清熱除濕不忘和血，苦寒滲利不傷脾胃，因此藥證相對(duì)。已有相關(guān)研究證實(shí)當(dāng)歸拈痛湯對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療效果[4]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與高尿酸血癥性腎病雖同為高尿酸血癥并發(fā)癥，但當(dāng)歸拈痛湯對(duì)高尿酸血癥性腎病作用機(jī)理的研究仍較少。本實(shí)驗(yàn)將當(dāng)歸拈痛湯應(yīng)用于高尿酸血癥性腎病模型小鼠，旨在探討其中醫(yī)證候特點(diǎn)與作用機(jī)制，為增加本病臨床治療效果提供一定依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性KM小鼠72只，體重(28±2)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。許可證號(hào)：SCXK(魯)20130001。

2 藥物與試劑 當(dāng)歸拈痛湯：按照組方比例(羌活、茵陳蒿、當(dāng)歸各15 g，防風(fēng)、知母、蒼術(shù)、豬苓、澤瀉各 9 g，白術(shù)、黃芩、升麻各3 g，葛根、苦參、黨參各6 g，土茯苓40 g，甘草10 g)，提前浸泡，加水煎煮3次后混勻，旋蒸濃縮至0.25 g/ml的藥液待用。乙胺丁醇，腺嘌呤，苯溴馬隆。尿酸檢測試劑盒(批號(hào)20180612)、尿素氮檢測試劑盒(批號(hào)20180531)、肌酐檢測試劑盒(批號(hào)20180608)、一氧化氮檢測試劑盒(批號(hào)20180530)均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。eNOS檢測試劑盒(批號(hào)201805)，ET-1檢測試劑盒(批號(hào)201805)，購自北京方程嘉鴻科技有限公司。

3 主要儀器 SC-3612型低速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司出品)，酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，型號(hào)Mulitiskan FC)，紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司，型號(hào)UV-5200)。

4 模型制備 參照文獻(xiàn)[5]，利用乙胺丁醇與腺嘌呤相結(jié)合的造模法制備高尿酸血癥性腎病小鼠模型，將乙胺丁醇與腺嘌呤分別以100 mg/kg、250 mg/kg劑量，采用灌胃法給藥，每天上午固定時(shí)間給造模藥1次，每只小鼠按照體重給藥，持續(xù)21 d后造成高尿酸血癥性腎病動(dòng)物模型。

5 實(shí)驗(yàn)方法 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將其隨機(jī)分為空白組、模型組、苯溴馬隆組(20 mg/kg)、當(dāng)歸拈痛湯高、中、低劑量組。灌胃造模時(shí)間在上午的固定時(shí)間，持續(xù) 21 d。實(shí)驗(yàn)1～7 d固定時(shí)間給模型組、苯溴馬隆組、當(dāng)歸拈痛湯各劑量組進(jìn)行灌胃造模。自第8天起，下午固定時(shí)間進(jìn)行當(dāng)歸拈痛湯高、中、低劑量組給藥，分別給予38、19、9.5g/(kg·d) 當(dāng)歸拈痛湯藥液，苯溴馬隆組給予20 mg/(kg·d)，連續(xù)給藥14 d.

6 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)第22天，小鼠眼球取血，制備血清檢測血尿酸、血尿素氮、血清肌酐、血清一氧化氮含量，eNOS水平，ET-1水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將檢測結(jié)果通過 SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)、組間參數(shù)方差齊性檢驗(yàn)，單因素ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況 小鼠初分組情況相同，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至3周后各實(shí)驗(yàn)組模型小鼠毛色暗淡，皮毛散亂，精神狀況差。模型組BUA，CR，BUN水平顯著上升(P<0.01)，造模成功。

2 模型小鼠尿酸代謝情況 BUA的水平 分析檢測結(jié)果后，結(jié)果如表1所示，與模型組相比，當(dāng)歸拈痛湯與苯溴馬隆均可顯著降低小鼠血清尿酸含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組小鼠BUA水平及XOD活性

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01

3 當(dāng)歸拈痛湯對(duì)腎功能及腎血管保護(hù)的效果

3.1 血清中CRE、BUN水平比較：如表2所示，造模后，與空白組進(jìn)行比較，各組CRE、BUN水平顯著上升(P<0.05)，當(dāng)歸拈痛湯各劑量組及苯溴馬隆組均可降低血清CRE、BUN水平，起到保護(hù)腎功能的作用。

表2 各組小鼠血清中BUN、CR水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與苯 溴馬隆組比較，▲P<0.05

3.2 血清中ET-1、eNOS、NO水平：制備高尿酸血癥性腎病模型3周后，模型組小鼠NO、eNOS水平顯著降低(P<0.01)，ET-1水平顯著上升。當(dāng)歸拈痛湯各劑量組及苯溴馬隆組相比模型組小鼠NO、eNOS水平顯著上升(P<0.05)，ET-1水平顯著下降(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠血清中ET-1、eNOS、NO水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與空白組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，△△P<0.01；與苯 溴馬隆組比較，▲P<0.05

討 論

高尿酸血癥性腎病作為高尿酸血癥的主要并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為血尿酸過度升高，蛋白尿，夜尿增多，滲尿等，晚期可出現(xiàn)慢性腎功能不全[6-7]。近年來，隨著人民飲食結(jié)構(gòu)的改變，飲食中攝入嘌呤含量增多，發(fā)病率逐年上升?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病是由于尿酸排泄過少或體內(nèi)嘌呤代謝紊亂，導(dǎo)致血尿酸過飽和，尿酸結(jié)晶沉積于各級(jí)腎小管和腎小球血管，形成局部病灶，如局部血管阻塞、萎縮、壞死，出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，久之出現(xiàn)腎功能衰竭[8]。

高尿酸血癥性腎病根據(jù)中醫(yī)理論，其發(fā)病機(jī)制為患者先天稟賦不足或飲食不節(jié)致脾胃失和、恣欲損及腎元，先、后天之本俱傷而致腎失溫化、脾失健運(yùn)，進(jìn)而津液運(yùn)化失常、痰飲內(nèi)停，濕熱下注。痰濕阻滯氣機(jī)，濕熱濁邪，病涉血分。利用中醫(yī)理論進(jìn)行分析，采用當(dāng)歸拈痛湯藥證相對(duì)。方中羌活、防風(fēng)、升麻、葛根等風(fēng)藥以風(fēng)勝濕，茵陳蒿清熱利濕，當(dāng)歸、黨參養(yǎng)血活血健脾益氣，豬苓、澤瀉清下焦?jié)駸?，黃芩、苦參、白術(shù)、蒼術(shù)、知母清熱燥濕，不耗陰津。綜合全方，清熱除濕不忘和血，苦寒滲利不傷脾胃，氣血同調(diào)，寒熱并用，內(nèi)外兼治。這在理論上為當(dāng)歸拈痛湯治療本病提供了理論依據(jù)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明本方藥物有降低尿酸的作用，為治療本病提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)[9]。

現(xiàn)有研究證實(shí)，BUA含量與高尿酸血癥性腎病預(yù)后呈負(fù)相關(guān)性[10]。在高尿酸血癥狀態(tài)下，BUA作為前炎癥因子，尿酸沉積后，刺激局部引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損害等，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，腎臟損害[11]。本研究數(shù)據(jù)證明當(dāng)歸拈痛湯各劑量組可有效降低BUA含量，這為治療本病提供了基礎(chǔ)。同時(shí)，當(dāng)歸拈痛湯還可顯著降低BUN、CRE含量。CRE和BUN是檢測腎功能的敏感指標(biāo)，本研究結(jié)果提示，當(dāng)歸拈痛湯在降低模型小鼠BUA含量的同時(shí)，起到保護(hù)小鼠腎臟功能的作用[12]。

已有研究人員發(fā)現(xiàn)，尿酸可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞，減少NO的產(chǎn)生，導(dǎo)致Ach誘導(dǎo)的血管舒張作用減弱，同時(shí)NO減少會(huì)增加ET-1釋放[13]。ET為最強(qiáng)縮血管物質(zhì)，可以加快內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷，引起腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞損傷，改變腎小球血流動(dòng)力學(xué)，影響皮質(zhì)腎血管收縮，形成腎小球病變損害[14]。其中源自eNOS的NO是維持腎血管低張力的必要調(diào)節(jié)劑，維持血管壁構(gòu)型起到重要作用[15]。其中NO、eNOS、ET-1作為高尿酸血癥性腎病內(nèi)皮細(xì)胞損傷及腎功能損傷的關(guān)鍵因子，也是反映腎臟內(nèi)皮細(xì)胞功能傷害及腎損傷進(jìn)程的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)歸拈痛湯各劑量組相比模型組eNOS、NO水平顯著上升，ET-1水平顯著下降，提示當(dāng)歸拈痛湯可以首先降低BUA含量，升高血中eNOS、NO水平，進(jìn)而降低ET-1水平，最終來抑制腎臟內(nèi)皮細(xì)胞功能損害進(jìn)程，緩解腎臟功能損傷，這與BUN、CRE含量變化特點(diǎn)相一致，推測其為當(dāng)歸拈痛湯發(fā)揮腎臟保護(hù)功能的可能機(jī)制。

綜上，當(dāng)歸拈痛湯可以通過降低BUA含量而升高血中eNOS、NO水平，進(jìn)而降低ET-1水平，達(dá)到對(duì)腎臟組織內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球血管的保護(hù)，從而降低BUN、CRE含量。此為其對(duì)于高尿酸血癥性腎病可能作用機(jī)制，本方其他的作用機(jī)制及相互作用有待進(jìn)一步研究。