胃泌素在結(jié)腸癌患者中的表達及其受體拮抗劑對人結(jié)腸癌細胞株的抑制作用及其對P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

王斌峰，鄭麗芳，徐秀華，黃 鋒

王斌峰，鄭麗芳，徐秀華，金華市中心醫(yī)院金西院區(qū)/金華市婺城區(qū)第一人民醫(yī)院檢驗科 浙江省金華市 321075

黃鋒，天津市東麗醫(yī)院消化科 天津市 300300

核心提要： 胃泌素在結(jié)腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關(guān), 分化程度越高, 其表達量越高, 胃泌素受體拮抗劑在一定濃度范圍內(nèi)可拮抗胃泌素促增殖效應(yīng), 其機制與上調(diào)P38、磷酸化-P38、BAX表達及下調(diào)Bcl-2表達有關(guān).

0 引言

結(jié)腸癌(colon cancer, CC)是我國常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤,早期缺乏特異性癥狀診斷率較低, 導(dǎo)致患者喪失根治性機會, 病死率較高, 極大危害患者生命健康. 胃泌素主要是由胃腸道G細胞分泌一種激素, 與胃泌素受體結(jié)合后可刺激胃酸分泌, 促進胃腸道黏膜生長. 既往研究證實, 部分結(jié)腸腫瘤細胞株能產(chǎn)生胃泌素, 且大腸癌細胞表面表達有胃泌素受體, 因此推測癌細胞能通過自身分泌的胃泌素與對應(yīng)受體作用, 實現(xiàn)相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng), 影響著腫瘤細胞增殖, 但其詳細作用及機制尚未明確[1,2].絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一組能被胃泌素等激素激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶, 負責(zé)細胞表面與細胞核內(nèi)部間信號傳遞[3].而P38 MAPK是一種重要細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子, 與凋亡的啟動、細胞周期的靜止等息息相關(guān)[4]. 本研究選取30例CC患者, 分析胃泌素在CC患者中的表達, 并探討其受體拮抗劑對人結(jié)腸癌細胞株的抑制作用及對P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響, 報道如下.

1 材料和方法

1.1 材料 胃泌素受體/膽囊收縮素-B受體(cholecystokinin-B receptor, CCK-BR)mRNA擴增引物(上海生工生物公司)；人大腸癌細胞株SW480(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)； 熒光染料(Biosharp公司)； 胎牛血清與RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Fermentas公司)； 胰蛋白酶(碧云天公司)； Trizol試劑(美國Invitrogen公司)； 5-肽胃泌素(Biosharp公司)； P38與磷酸化P38兔抗人多克隆抗體(美國Cell Signaling technology公司)； 丙谷胺(中國藥品生物檢定所)； β-肌動蛋白抗體(碧云天公司)； 噻唑蘭(MTT, Bio-sharp公司)； ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore公司)； 細胞周期染色試劑盒(凱基公司)； 兔抗人多克隆抗體(Biosharp公司)； 羊抗小鼠多克隆抗體、PVDF膜(上海戶實)； 離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)； 液氮箱(上海京燦)； 流式細胞儀(美國貝克曼)； 酶標儀(BIOBASE-EL10A, 濟南來寶醫(yī)療器械).

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測胃泌素表達： 取2016-01/2018-10我院病理科30例CC患者結(jié)腸癌組織標本根據(jù)世界衛(wèi)生組織惡性腫瘤分化程度標準分為低分化標本、中分化標本、高分化標本, 同時選取癌旁腸黏膜組織標本, 切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水, 緩沖液清洗2次, 滴甲醇配制0.3%過氧化氫阻斷液, 10 min后緩沖液清洗, 滴加一抗工作液(稀釋度1：200)37 ℃孵育1-2 h, 緩沖液清洗, 滴加抗體增強劑, 室溫放置20 min, 緩沖液清洗, 滴加二抗, 室溫放置30 min, 緩沖液清洗, 滴加1-2滴DAB Plus Chromogen, 自來水沖洗, 復(fù)染, 脫水, 透明, 封片, 觀察不同分化程度患者結(jié)腸癌組織中胃泌素表達.

1.2.2 SW480結(jié)腸癌細胞株培養(yǎng)： (1)細胞復(fù)蘇： 培養(yǎng)基、PBS于37 ℃恒溫水浴預(yù)熱備用, 取出SW480細胞冷凍管,立即放入37 ℃水槽中快速解凍, 離心, 棄上清, 加入培養(yǎng)基, 吹打, 移入培養(yǎng)瓶中, 加入適量培養(yǎng)基, 放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 瓶壁長滿＞80%時, 進行細胞傳代； (2)細胞傳代： 棄去長滿細胞培養(yǎng)瓶中原培養(yǎng)液, 加入0.5 ml胰蛋白酶, 瓶口塞好橡皮塞, 放在倒置鏡下觀察細胞, 貼壁細胞逐漸趨于圓形, 于未漂起時棄去胰蛋白酶, 加入10 ml培養(yǎng)液終止消化, 用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液, 分裝后繼續(xù)培養(yǎng)； (3)細胞凍存： 工作臺與細胞室以紫外線進行15 min照射, 預(yù)熱小牛血清、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等備用, 收集處于對數(shù)生長期細胞(凍存前日最好進行換液),用吸管吸出培養(yǎng)瓶中細胞培養(yǎng)液, PBS洗2遍, 吸出沖洗液, 加入胰蛋白酶消化處理, 棄去消化液, 加入少量新培養(yǎng)液, 吸管吸取培養(yǎng)液對瓶壁上細胞進行拍打, 至細胞懸液后, 加入培養(yǎng)液至凍存管中, 1000 r/min離心10 min, 去上清, 加入凍存液, 吹打成均勻狀態(tài), 放置凍存管至4 ℃10 min、-20 ℃ 30 min、-80 ℃ 16-18 h、液氮槽長期保存.

1.2.3 分組： 將細胞分為對照組(不進行任何藥物處理)、胃泌素組(分別加入6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 mg/L胃泌素進行處理)、丙谷胺組(分別加入8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00 mg/L丙谷胺進行處理)、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組(加入12.5 mg/L胃泌素與8.00、16.00、32.00、64.00、128.00、256.00 mg/L丙谷胺進行處理).

1.2.4 檢測CCK-BR表達： Trizol試劑提取總RNA, 加入逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA, 以cDNA為模板進行PCR反應(yīng), 條件為： 共39個循環(huán), 預(yù)變性95 ℃ 30 s, 之后每一步變性95 ℃ 15 s, 退火延伸53.9 ℃ 30 s, 制作溶液曲線, 95 ℃變性30 s, 冷卻至65 ℃, 從65 ℃ 10 s開始,每步增加0.5 ℃, 至95 ℃ 10 s, β-肌動蛋白引物序列上下游分別為5′-TGACGTGGACATCGCAAG-3、5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3, CCK-BR引物序列上下游分別為5′-TCTCGCGAGCTCTACTTAGGG-3、5′-AC-CGACGATGCACGTTGAAG-3, 擴增產(chǎn)物為203 bp、185 bp.

1.2.5 檢測結(jié)腸癌細胞株SW480活力： 取對數(shù)生長期SW480細胞, 加入胰蛋白酶消化處理成單細胞懸液, 應(yīng)用含胎牛血清10%培養(yǎng)液調(diào)整細胞為5×104個/ml濃度,以每孔200 μl接種于96孔培養(yǎng)板, 24 h細胞貼壁后, 去培養(yǎng)液, PBS洗2遍, 加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 24 h后再以每孔200 μl 10%胎牛血清加入. 各組按照預(yù)設(shè)定方法與濃度進行對應(yīng)處理, 分別設(shè)6個復(fù)孔, 培養(yǎng)48 h, 每孔加入10 μl濃度為5 mg/ml MTT, 放入孵育箱孵育(4 h, 37 ℃),去培養(yǎng)液, 各孔加入DMSO 150 μl, 震蕩處理后應(yīng)用酶標儀檢測光吸收值(OD), 以492 nm下OD表示SW480活力.

1.2.6 細胞增殖檢測： 采用與1.5相同方法調(diào)整細胞濃度為1.7×105個/ml, 以每孔2 ml接種于6孔培養(yǎng)板, 培養(yǎng)24 h, 更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 24 h后去上清液, 以每孔2 ml加入含有處理因素1%胎牛血清, 胃泌素組(12.50 mg/L)、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組(12.5 mg/L胃泌素與16.00 mg/L丙谷胺)均設(shè)復(fù)孔5個, 進行48 h培養(yǎng),消化離心后去上清, 加入1 ml冷PBS震蕩, 離心, 去上清,滴入70% 1 ml冷乙醇進行固定, 過夜(4 ℃), 實施DNA、蛋白質(zhì)染色, 流式細胞儀檢測細胞增殖情況.

1.2.7 P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路檢測： 細胞總蛋白樣品實施電泳處理后, 轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 封閉120 min, TBST漂洗2次, 應(yīng)用5%胎牛血清稀釋至1：2000, 加入一抗, 4 ℃過夜,TBST漂洗3次, 加入二抗(辣根過氧化物酶標記過), 孵育120 min, TBST漂洗3次, 應(yīng)用ECL顯影, 放于全自動發(fā)光圖像系統(tǒng)內(nèi)成像, 分析平均光密度, 最終結(jié)果根據(jù)目標基因/β-肌動蛋白確定.

1.2.8 觀察指標： (1)觀察結(jié)腸癌組織中胃泌素表達； (2)統(tǒng)計SW480中CCK-BR表達情況； (3)比較各組結(jié)腸癌細胞株SW480活力； (4)比較各組細胞增殖指數(shù)； (5)比較各組P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達情況：P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、細胞凋亡促進基因(BAX).

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(mean±SD)表示, 多組間比較以單因素方差進行分析, 兩兩比較以LSD-t檢驗.P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中胃泌素表達情況 胃泌素陽性反應(yīng)著色于細胞質(zhì), 細胞核未見染色, 分化程度越高, 胃泌素表達陽性率越高, 而在癌旁腸黏膜組織中幾乎不表達(圖1-4).

2.2 CCK-BR表達情況 SW480中CCK-BR PCR擴增產(chǎn)物為185 bp, 表達量為(1.57±0.15).

2.3 結(jié)腸癌細胞株SW480活力 胃泌素組、胃泌素聯(lián)合丙谷胺組不同濃度范圍內(nèi)SW480 OD值比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)； 胃泌素組6.25-200.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值均高于對照組(P＜0.05)； 胃泌素組12.50 mg/L時SW480 OD值最高(P＜0.05)； 胃泌素組25.00-200.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)； 丙谷胺組8.00-256.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)； 胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組在12.50 mg/L胃泌素聯(lián)合16.00 mg/L丙谷胺時, SW480 OD值最低, 低于對照組(P＜0.05), 之后隨著丙谷胺濃度增加, SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05). (表1、圖5).

2.4 細胞增殖情況 各組細胞增殖指數(shù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)； 丙谷胺組(16.00 mg/L)細胞增殖指數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)； 胃泌素組(12.50 mg/L)細胞增殖指數(shù)高于丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05). (表2).

2.5 P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 各組P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、Bcl-2蛋白、BAX蛋白表達比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)； 胃泌素組(12.50 mg/L)P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、BAX蛋白低于對照組、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L), Bcl-2蛋白表達高于對照組、丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05). (表3).

表1 比較各組結(jié)腸癌細胞株SW480活力(mean±SD)

表2 比較各組細胞增殖指數(shù)(mean±SD，%)

圖2 低分化程度結(jié)腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖3 中分化程度結(jié)腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖4 高分化程度結(jié)腸癌組織中胃泌素表達情況.

圖5 各組結(jié)腸癌細胞株SW480活力.

3 討論

胃泌素廣泛存在于胰腺組織、胃腸道內(nèi), 是一種單拷貝基因, 由G細胞轉(zhuǎn)錄后, 在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯生成前胃泌素原, 并經(jīng)蛋白酶切割與氨基酸衍生化作用完成翻譯加工, 形成胃泌素[5]. 動物學(xué)實驗表明, 胃泌素可通過與自身受體結(jié)合促進正常胃腸道黏膜生長[6]. 國外學(xué)者研究證實, 胃泌素在CC患者血清中呈高表達狀態(tài)[7,8]. 近年來人們發(fā)現(xiàn)胃泌素除了這種經(jīng)典遠距分泌外, 還擁有其他分泌途徑[9-11]. 如Rai等[12]研究指出, 胃癌患者腫瘤組織細胞膜表面存在胃泌素受體, 并推測這可能參與了惡性腫瘤細胞生長的調(diào)控. 本研究應(yīng)用PCR檢測CC癌細胞組織CCK-BR表達, 發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞株SW480中存在CCK-BR, 提示胃泌素能通過旁分泌途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng), 即胃泌素不僅能作用于自身細胞上該因子受體, 參與惡性腫瘤發(fā)生, 同時癌細胞產(chǎn)生胃泌素亦能與其表達胃泌素受體結(jié)合, 調(diào)控惡性腫瘤增殖過程. 同時本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn), 分化程度越高, CC組織中胃泌素表達陽性率越高, 提示CC對胃泌素存在依賴性.

體外研究證實, 胃泌素異常表達造成的細胞生長失控可被胃泌素受體拮抗劑抑制[13,14]. 丙谷胺系抗酸藥及治療消化性潰瘍藥物, 具有抗胃泌素作用[15,16]. 本研究結(jié)果顯示, 胃泌素組6.25-200.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值均高于對照組(P＜0.05), 提示胃泌素可促進CC細胞株SW480的表達, 抑制細胞凋亡. 且胃泌素組12.50 mg/L時SW480 OD值最高(P＜0.05), 而25.00-200.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 說明胃泌素12.50 mg/L時促增生能力最強, 繼續(xù)增加胃泌素劑量抑制凋亡作用不再持續(xù)增強. 分析原因發(fā)現(xiàn), 正常情況下機體胃泌素與其受體處于動態(tài)平衡中, 發(fā)生病變時這種平衡被打破, 持續(xù)高表達胃泌素不斷與受體結(jié)合, 使受體減少, 當(dāng)胃泌素到達一定濃度, 由于受體數(shù)量限制,其促進惡性腫瘤細胞增殖作用亦趨于平衡[17-19]. 同時本研究還發(fā)現(xiàn), 丙谷胺組8.00-256.00 mg/L范圍內(nèi)SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 而12.50 mg/L胃泌素聯(lián)合16.00 mg/L丙谷胺SW480 OD值最低, 低于對照組(P＜0.05), 之后隨著丙谷胺濃度增加, SW480 OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05), 提示丙谷胺在16.00 mg/L時可拮抗胃泌素促增殖效應(yīng), 繼續(xù)增加濃度, 受其受體飽和影響, 不會增加拮抗效應(yīng), 這可為臨床治療CC提供思路與參考.

此外胃泌素組(12.50 mg/L)細胞增殖指數(shù)高于丙谷胺組(16.00 mg/L)、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組(12.5 mg/L+16.00 mg/L)(P＜0.05), 直接佐證了胃泌素能促進CC細胞增殖, 但其作用機制目前尚未明確. P38信號通路是MAPK四個亞家族之一, 信號傳導(dǎo)過程精確、復(fù)雜, 不同刺激因素可傳遞不同信息, 其中BAX是BCL-2基因家族中細胞凋亡促進基因, 其高表達可拮抗BCL-2促使細胞發(fā)生凋亡[20-23]. 鄒存華等[24]報道發(fā)現(xiàn), P38可通過上調(diào)uPA表達促進卵巢癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移. 隋欣等[25]研究指出, P38陽性高表達是胃腺癌預(yù)后生存期有利因素. 可見在不同疾病中P38信號通路具有不同生物學(xué)效應(yīng), 因此有必要探究其在CC中作用. 本研究結(jié)果顯示, 胃泌素組P38蛋白、磷酸化-P38蛋白、BAX蛋白低于對照組、丙谷胺組、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組, Bcl-2蛋白表達高于對照組、丙谷胺組、胃泌素組聯(lián)合丙谷胺組(P＜0.05),提示胃泌素能下調(diào)P38、磷酸化-P38、BAX表達及上調(diào)Bcl-2表達, 這可能是其促進CC增殖機制. 值得注意的是,目前已明確人結(jié)腸癌細胞株有HCT116、HT-29等多種,本研究僅對SW480進行探索, P38信號通路在其他類型是否具有相似影響有待后續(xù)基礎(chǔ)實驗及臨床實驗驗證.

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表3 比較各組P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路表達情況(mean±SD)

綜上所述, 胃泌素可抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480的凋亡, 且在結(jié)腸癌組織中的表達與腫瘤分化程度有關(guān),分化程度越高, 其表達量越高, 胃泌素受體拮抗劑在一定濃度范圍內(nèi)可拮抗胃泌素促增殖效應(yīng), 其機制與上調(diào)P38、磷酸化-P38、BAX表達及下調(diào)Bcl-2表達有關(guān).

文章亮點

實驗背景

結(jié)腸癌為臨床多見惡性腫瘤, 由于患者前期缺少特異性癥狀, 造成多數(shù)患者在就診時已失去最佳手術(shù)時機, 對患者身心健康造成了嚴重影響.

實驗動機

胃泌素和其受體能夠刺激分泌胃酸, 加速胃腸道內(nèi)黏膜的生長, 相關(guān)研究顯示, 胃泌素對腫瘤細胞增殖可能有促進作用.

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實驗方法

免疫組化檢測臨床結(jié)腸癌患者癌組織標本內(nèi)胃泌素陽性表達, 檢測丙谷胺組對人大腸癌SW480細胞活力、增殖和P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響.

實驗結(jié)果

結(jié)腸癌患者癌組織分化程度越高則胃泌素的陽性率也越高, 丙谷胺可有效抑制SW480細胞增殖.

實驗結(jié)論

胃泌素拮抗劑可抑制SW480細胞的增殖, 其作用機制可能和下調(diào)Bcl-2表達及上調(diào)P38、磷酸化-P38、BAX表達有聯(lián)系.

展望前景

今后還需進一步分析其他腸癌細胞如CaCo2、HT29、HCT116等的胃泌素表達水平, 為闡釋胃泌素對結(jié)腸癌患者癌細胞的影響提供更有力佐證.