核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白6在炎癥性腸病中作用機(jī)制研究進(jìn)展

朱 鳳，劉星星，范 恒

朱鳳，劉星星，范恒，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科 湖北省武漢市 430022

核心提要： 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白6(NLR family, pyrin domain containing6, Nlrp6)促進(jìn)IL-18及抗菌肽的分泌, IL-18可抑制IL-22BP的產(chǎn)生,增強(qiáng)IL-22作用, 并通過(guò)MyD88通路來(lái)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖； Nlrp6還可通過(guò)Toll-like receptors調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞分泌Mucoprotein2, 清除腸道細(xì)菌, 調(diào)節(jié)腸道免疫功能及維持腸道菌群穩(wěn)態(tài).

0 引言

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)為累及回腸、結(jié)腸、直腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病, 主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(crohn's disease, CD). 其臨床表現(xiàn)以腹痛、腹瀉及黏液膿血便為主, 癥狀易反復(fù)發(fā)作, 難以治愈, 且有一定的癌變傾向[1]. 該病多發(fā)于青少年, 在歐美國(guó)家發(fā)病率較高.近年我國(guó)發(fā)病率有增加趨勢(shì), 可能與我國(guó)人民生活方式改變有關(guān)[2]. 目前普遍認(rèn)為IBD的發(fā)病機(jī)制是由環(huán)境因素和腸道菌群共同作用, 激活遺傳易感個(gè)體腸道黏膜的免疫應(yīng)答, 引發(fā)一系列的炎癥反應(yīng), 使腸黏膜中的抗炎和促炎介質(zhì)失衡, 導(dǎo)致腸黏膜的病理改變. IBD目前的藥物治療主要包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑等, 配合調(diào)整患者生活方式, 但治療效果不理想, 且存在一定的副作用. 因此, 深入研究IBD的發(fā)病機(jī)制對(duì)于創(chuàng)新治療方法及治療藥物具有重要的臨床意義.

固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原體的第一道防線,亦是獲得性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ). 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding and oligomerization domainlike receptors, NLRs)家族是近年來(lái)研究比較多的一個(gè)參與免疫應(yīng)答的龐大的炎癥蛋白家族, 在細(xì)胞凋亡、炎癥、腫瘤等方面發(fā)揮著重要作用. 核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白6(NLR family, pyrin domain containing6, Nlrp6)是NLRs家族中一個(gè)比較特殊的成員, 目前對(duì)其有一定的研究, 但其功能和作用機(jī)理尚未完全明確. 本文就Nlrp6在IBD中的作用機(jī)制研究進(jìn)展作一綜述.

1 NLRs家族

NLRs家族是一類存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的模式識(shí)別受體, 可以識(shí)別結(jié)合某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的病原相關(guān)分子模式, 通過(guò)激活NF-κB、IFNr和其它炎性信號(hào)來(lái)促進(jìn)免疫反應(yīng), 參與機(jī)體免疫應(yīng)答[3]. 目前發(fā)現(xiàn)NLRs家族蛋白在人類有23種, 在小鼠有34種[4,5]. NLRs家族主要由氨基端(N端)結(jié)構(gòu)域、NOD結(jié)構(gòu)域、羧基端(C端)富含亮氨酸的重復(fù)序列三部分組成. N端為效應(yīng)結(jié)構(gòu)域, 介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用, 參與免疫應(yīng)答[6]. 不同類型NLRs分子因?yàn)槠銷端結(jié)構(gòu)域不同, 有其特定下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路. 根據(jù)N端結(jié)構(gòu)域不同, 目前NLRs家族分子分成四類[7]： (1)Ⅱ類反式激活因子, 調(diào)節(jié)主要組織相容性復(fù)合體MHCⅡ類分子的表達(dá)； (2)NOD1和NOD2, 主要功能是識(shí)別細(xì)菌肽聚糖亞單位, 并激活NF-κB信號(hào)通路發(fā)生免疫應(yīng)答[8]； (3)白細(xì)胞介素-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白激酶激活因子；(4)NLR家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白(NLR family, pyrin domain containing, NLRP). NLRs家族主要參與調(diào)節(jié)腸道的免疫信號(hào)通路和微生物菌群, 影響腸道的炎癥的發(fā)生[9,10].

2 Nlrp6蛋白的結(jié)構(gòu)及功能

Nlrp6是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抑制天然免疫反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路的NLRs蛋白家族成員, 其編碼基因位于人11號(hào)染色體. 在腸道組織中, Nlrp6高表達(dá)于腸上皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等非造血細(xì)胞[11]. Nlrp6可與含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)和含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)顆粒樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)通過(guò)N端PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白-蛋白連接作用組成細(xì)胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物(即Nlrp6炎癥小體), 最終產(chǎn)生白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-18等細(xì)胞因子, 參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答[12,13].

在Nlrp6缺失型小鼠中觀察到Nlrp6的功能是抑制NF-κB和MAPK的活化, 從而發(fā)揮促進(jìn)凋亡、抑制炎癥及腸道組織增殖的作用[14,15]. Nlrp6缺失型小鼠體內(nèi)的巨噬細(xì)胞在細(xì)菌感染時(shí)對(duì)NF-κB的激活增加, 并伴有NF-κB和MAPK依賴性細(xì)胞因子、趨化因子分泌增加, 免疫細(xì)胞數(shù)目明顯增加, 通過(guò)激活Toll樣受體(multiple tolllike receptors, TLR), 增強(qiáng)NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化, 說(shuō)明Nlrp6可能在識(shí)別病原體后抑制TLR通路, 防止炎癥擴(kuò)大[16]. NF-κB相關(guān)細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和IL-6在Nlrp6缺失型小鼠體內(nèi)顯著升高[11], TNF-α和IL-6可以激活腸上皮細(xì)胞STAT3途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17,18]. ASC與其他Nlrp蛋白共表達(dá)并不能激活Caspase-1前體, 表明Nlrp6能夠有效地激活Caspase-1前體, 促使細(xì)胞發(fā)生凋亡, 阻止細(xì)胞的無(wú)限增殖, 抑制腫瘤發(fā)生[19].

近年來(lái), Ranson等[20]觀察到Nlrp6在人類CD中上調(diào),但在人類UC中沒(méi)有顯著程度上調(diào). 相反, Alipour等[21]發(fā)現(xiàn)IBD亞群中Nlrp6表達(dá)有降低的趨勢(shì), 但這沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 進(jìn)一步研究表明, 在CD和UC患者的上皮層中Nlrp6的表達(dá)降低. 動(dòng)物模型進(jìn)一步證實(shí)了Nlrp6表達(dá)與腸屏障完整性之間的關(guān)聯(lián). 在小鼠的WAS(避水應(yīng)激)誘導(dǎo)的小腸炎癥(腸炎)中報(bào)道了Nlrp6水平降低[22]. 然而, 在結(jié)腸炎小鼠模型中Nlrp6的表達(dá)尚不完全清楚. 由此可見(jiàn), Nlrp6在調(diào)節(jié)腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)中的作用日益受到重視, 研究Nlrp6炎性小體及其配體有助于深入探討UC的發(fā)病機(jī)制.

3 Nlrp6/IL-18信號(hào)通路在調(diào)節(jié)IBD腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用

Nlrp6炎性小體導(dǎo)致蛋白水解切割和激活caspase-1, 之后釋放促炎細(xì)胞因子IL-18[23]. 為了評(píng)估Nlrp6對(duì)結(jié)腸炎的影響, 進(jìn)行了幾種使用Nlrp6-/-小鼠的研究[24,25]. 在該實(shí)驗(yàn)中, Nlrp6-/-小鼠顯示出對(duì)DSS誘發(fā)的結(jié)腸炎增強(qiáng)的易感性. 研究人員還觀察到IL-18的水平降低了. 此外, 使用16SrRNA分析腸道菌群組成揭示了Nlrp6-/-小鼠腸道中更多的致癌微生物群. 我們了解到, 炎癥小體的激活導(dǎo)致多重下游效應(yīng), 包括通過(guò)蛋白水解切割產(chǎn)生活化形式的前IL-18. Levy等[26]發(fā)現(xiàn)敲除IL-18導(dǎo)致結(jié)腸炎嚴(yán)重程度和腸道細(xì)菌群落的顯著惡化, 類似于Nlrp6-/-小鼠. 這些結(jié)果表明, Nlrp6對(duì)腸道細(xì)菌群落的影響可能部分取決于IL-18, 且IL-18在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中具有保護(hù)作用. Kempster等[27]認(rèn)為病態(tài)的IL-18過(guò)度激活存在差異. 然而, IL-18的不同表達(dá)也可能導(dǎo)致關(guān)于IL-18在NEC中的作用的“沖突”.觀察發(fā)生在回腸中的環(huán)狀物, 而不是它在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的作用(大多數(shù)嚴(yán)重的遠(yuǎn)端結(jié)腸). 為此, Nlrp6在小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中的缺乏改變了糞便微生物, 其特征是細(xì)菌門擬桿菌和TM7[11]. Seregin等[28]證明使用不依賴于上皮損傷和修復(fù)的IBD替代模型, Nlrp6通過(guò)限制IL-10-/-小鼠致結(jié)腸炎病菌 A.muciniphila的定植來(lái)預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)展. 在腸道中, AMP是參與該組織的先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分. Nlrp6可以調(diào)節(jié)“健康”宿主-微生物界面的機(jī)制, 從IgA和粘液分泌到AMP產(chǎn)生[29,30].

由此可見(jiàn)在IBD中, Nlrp6炎性小體信號(hào)通路主要是通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-18來(lái)介導(dǎo)免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài). 深入研究Nlrp6/IL-18通路的作用機(jī)制, 有利于揭示腸道免疫紊亂和菌群失調(diào)在UC發(fā)病中的作用.

4 Nlrp6-Muc2軸對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞免疫功能和微生物菌群的影響

在UC患者和DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中, 可以觀察到結(jié)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞通常被耗盡, 粘液合成和分泌減少[31,32]. 在腸道病原體清除實(shí)驗(yàn)中, 固有層物質(zhì)會(huì)被微生物和病原體穿透[33]. Wlodarska等[9]觀察到與野生型小鼠相比, Nlrp6缺陷小鼠的C.rodentium負(fù)荷和病理變化增加. ASC-/-和caspase-1/11-/-小鼠也表現(xiàn)出無(wú)法清除C.rodentium. 這些結(jié)果表明Nlrp6炎性體激活是宿主防御A/E病原體感染的關(guān)鍵. Muc2粘蛋白是由杯狀細(xì)胞產(chǎn)生的大型糖蛋白, 形成先天宿主防御的第一線[34].Muc2-/-小鼠會(huì)發(fā)生自發(fā)性結(jié)腸炎并且不能阻止從黏膜表面附著和去除粘附的病原體[35]. Nlrp6在整個(gè)腸黏膜中高表達(dá), 特別是在杯狀細(xì)胞中. 該發(fā)現(xiàn)表明Nlrp6調(diào)節(jié)粘液分泌, 進(jìn)一步的研究表明, Nlrp6-/-小鼠的腸上皮細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的杯狀細(xì)胞增生. 然而, 杯狀細(xì)胞粘液顆粒分泌受到抑制, 缺乏厚的連續(xù)覆蓋的內(nèi)部黏膜層[9].

有報(bào)道指出, Nlrp6僅調(diào)節(jié)粘液顆粒和腸上皮的融合以及粘液的分泌, 但不影響粘液的表達(dá). 自噬對(duì)于Paneth細(xì)胞、破骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞的功能至關(guān)重要[36-38]. 同樣,在Nlrp6-/-小鼠的上皮中缺乏可見(jiàn)的自噬體形成, 表明自噬過(guò)程是由Nlrp6介導(dǎo)的粘液顆粒分泌所必需的過(guò)程.此外, caspase-1/11-/-和ASC-/-小鼠的杯狀細(xì)胞顯示明顯缺乏粘液分泌.

通常, 腸道內(nèi)部粘液層將結(jié)腸細(xì)胞與微生物群分離,這樣就可以阻止細(xì)菌接觸隱窩, 破壞其結(jié)構(gòu)及功能[39].Birchenough等[40]報(bào)道細(xì)菌的流入增加了隱窩附近TLR配體的濃度并激活了前杯狀細(xì)胞(sentinel goblet cells,senGCs), 這是在Nlrp6炎性體激活之前, 由內(nèi)吞作用下游的TLR-MyD88信號(hào)通路傳導(dǎo)引起的. 這導(dǎo)致Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)驅(qū)動(dòng)化合物Muc2分泌、GJ依賴性細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的產(chǎn)生、功能性GC的Muc2分泌和活化的senGC的排出.這種方式清除了隱窩中的細(xì)菌, 從而保護(hù)下部隱窩和腸干細(xì)胞免受細(xì)菌侵入. Nlrp6控制senGC排出, 并促進(jìn)活化的senGC誘發(fā)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo), 最終誘導(dǎo)相鄰功能性GC中的Muc2分泌.

圖1 Nlrp6調(diào)節(jié)腸道免疫功能和維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的多種機(jī)制.

由此可見(jiàn), Nlrp6對(duì)于腸道上皮細(xì)胞的杯狀細(xì)胞表達(dá)Muc2粘液蛋白具有重要作用, 而Muc2可以調(diào)節(jié)腸道免疫及微生物, 保護(hù)腸道黏膜, 故Nlrp6-Muc2軸對(duì)治療IBD可以提供新的治療思路.

5 Nlrp6在IBD炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌中的調(diào)節(jié)作用

眾所周知, IL-22可以促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[41]. 作為可溶性IL-22受體, IL-22BP特異性結(jié)合IL-22并阻止IL-22與IL-22的結(jié)合膜結(jié)合IL-22R1可抑制上皮細(xì)胞增殖[42].Castleman等[43]表明人腸道微生物群(包括共生細(xì)菌)間接調(diào)節(jié)結(jié)腸ILC3功能以誘導(dǎo)IL-22, IL-22通過(guò)其對(duì)上皮屏障的功能性作用促進(jìn)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài). 當(dāng)腸道上皮屏障完整性受損時(shí), 例如人類免疫缺陷病毒感染和IBD, 來(lái)自腸腔的微生物易位到固有層中, 誘導(dǎo)多種潛在的致病性免疫應(yīng)答. Huber等[44]發(fā)現(xiàn)Nlrp6炎性小體導(dǎo)致IL-18依賴性降低, IL-22BP的下調(diào), 從而增加上皮細(xì)胞增殖. 此外, IL-18還通過(guò)MyD88信號(hào)通路促進(jìn)上皮細(xì)胞增值. 通過(guò)用AOM或DSS治療誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)癌癥小鼠模型,Nlrp6-/-小鼠比野生型小鼠發(fā)展出更多更大的腫瘤[45]. 在該研究中, 作者首次闡述了Nlrp6在腫瘤發(fā)展中的保護(hù)作用. 進(jìn)一步的研究表明, Nlrp6下調(diào)上皮細(xì)胞增殖的相關(guān)因子, 包括Wnt和腫瘤中的Notch靶基因[46]. 正如上述研究報(bào)道的那樣, Nlrp6可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成. 在Nlrp6-/-小鼠中攜帶的致結(jié)腸炎腸道微生物群落和微生物群誘導(dǎo)的趨化因子(C-C基序)配體5(CCL5)一起通過(guò)IL-6途徑局部激活促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖[47].

結(jié)直腸癌(CRC)是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的癌癥之一, 但很多有關(guān)CRC發(fā)展的潛在分子機(jī)制仍然未知[48]. 一個(gè)主要的風(fēng)險(xiǎn)因素CRC的發(fā)展是IBD的延長(zhǎng). 進(jìn)一步證明NF-κB激酶依賴性途徑的經(jīng)典抑制劑對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展至關(guān)重要, 突出了CRC發(fā)病過(guò)程中炎癥的重要性[49,50].腸道微生物群落使一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng), 最近顯示出對(duì)動(dòng)物模型和人類的健康和疾病有很大的影響[51-54]. 腸道微生物群被認(rèn)為影響IBD的發(fā)病機(jī)制, 因?yàn)榭股睾鸵嫔闹委熆梢愿纳颇承㊣BD亞組患者的疾病癥狀[55].此外, 最近證實(shí)IBD患者的腸道微生物群的一些成員豐度降低, 包括厚壁菌門和擬桿菌[56,57]. 牛鏈球菌/溶血弧菌, 產(chǎn)腸毒素細(xì)菌脆弱體和大腸桿菌NC101已被認(rèn)為是CRC的危險(xiǎn)因素[58,59]. 此外, 一些小鼠模型中的自發(fā)性腸炎在無(wú)菌環(huán)境中無(wú)法發(fā)展[60]. Hu等[46]證明了Nlrp6-/-和ASC-/-小鼠含有一種在WT小鼠中可傳染的腸道菌群微生物群落, 它可以導(dǎo)致結(jié)腸炎惡化. 在這里, 使用(AOM)-DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)CRC模型(CAC), 證明了WT小鼠與Nlrp6-/-和ASC-/-共養(yǎng)發(fā)展為炎癥誘導(dǎo)的CRC作用的戲劇性增強(qiáng)趨勢(shì), 其通過(guò)誘導(dǎo)IL-18改變其介導(dǎo)的微生物群落和由此誘導(dǎo)的CCL5依賴性結(jié)腸炎癥和IL-6途徑的激活. 由于IBD的持續(xù)炎癥刺激容易導(dǎo)致癌變, 形成CRC, 因此, 預(yù)防和及時(shí)治療IBD可以有效控制CRC的發(fā)生. 由此可知, Nlrp6通過(guò)IL-18影響腸道微生物菌群, 進(jìn)一步通過(guò)CCL-5及IL-6的激活影響IBD相關(guān)性CRC的發(fā)生發(fā)展. 因此, 此實(shí)驗(yàn)研究對(duì)于我們治療IBD相關(guān)性CRC具有臨床指導(dǎo)意義.

6 結(jié)論與展望

Nlrp6通過(guò)作用于caspase-1產(chǎn)生IL-18, 從而促進(jìn)AMPs的分泌, 清除腸道細(xì)菌, 調(diào)節(jié)腸道免疫功能及維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)； IL-18還可抑制IL-22BP的產(chǎn)生, 增強(qiáng)IL-22作用, 并通過(guò)MyD88通路來(lái)促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖； Nlrp6通過(guò)TLR調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞分泌Muc2粘蛋白, Muc2也可調(diào)節(jié)腸道免疫及微生物, 保護(hù)腸黏膜(圖1). Nlrp6可通過(guò)各種途徑影響腸道免疫及菌群穩(wěn)態(tài), 而這正是IBD的主要致病原因. 因此, 深入研究Nlrp6作用機(jī)制, 有助于揭示IBD發(fā)病機(jī)制. 由于IBD有一定癌變傾向, Hu[46]發(fā)現(xiàn)Nlrp6可作用于NOTCH及Wnt靶點(diǎn), 激活CCL5及IL-6信號(hào)通路, 調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖, 影響IBD相關(guān)性CRC. Nlrp6在腫瘤的形成中也具有保護(hù)作用. Nlrp6的表達(dá)已被人提出作為結(jié)腸腺癌檢測(cè)的診斷標(biāo)記物[61]. 由上可知, 目前的研究證據(jù)顯示Nlrp6參與維持上皮屏障的完整性、促進(jìn)腸上皮傷口愈合、抑制腸上皮過(guò)度增殖和細(xì)胞凋亡, 并在炎癥、腫瘤等多種疾病發(fā)生發(fā)展中具有抑制作用. 因此,Nlrp6及其相應(yīng)細(xì)胞因子的表達(dá)水平可以作為IBD及相關(guān)腫瘤的一個(gè)很有價(jià)值的生物標(biāo)記物和治療的靶點(diǎn).