解淀粉芽胞桿菌HN對(duì)番茄、黃瓜病原菌的抑制作用

周 可，魏冬苓，張峰峰，趙 瓊，趙玉潔，謝鳳行

（天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，天津300384）

番茄早疫病是由茄鏈格孢菌（Alternaria solani）侵染所致的一種世界性植物真菌病害，茄鏈格孢菌能侵染番茄的葉、莖和果，可危害各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的番茄植株，嚴(yán)重時(shí)會(huì)給菜農(nóng)造成80%的經(jīng)濟(jì)損失[1-2].黃瓜枯萎病是保護(hù)地黃瓜栽培常見(jiàn)的一種土傳性真菌病害，其病原菌為黃瓜?；图怄哏牭毒‵usarium oxysporum（Schl.）f.sp.Cucumerinum owen），在我國(guó)各地均有發(fā)生，發(fā)病率一般為l5%～25%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)60%～70%，有的甚至全田枯萎死亡，因此該病害被認(rèn)為是黃瓜病害中的癌癥[3].黃瓜灰霉病由灰葡萄菌（Botrytis cinerea）引發(fā)，是溫室黃瓜高發(fā)病害之一，輕者減產(chǎn)20%～30%，重者減產(chǎn)50%以上[4].生產(chǎn)上對(duì)上述3 種病害的防治主要依靠化學(xué)藥劑，但是化學(xué)農(nóng)藥毒性較高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解，會(huì)造成環(huán)境和食品污染，嚴(yán)重威脅人們的身體健康.長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑，也易使病菌產(chǎn)生抗藥性，降低藥劑的防治效果.生物防治則具有對(duì)人畜安全、不污染環(huán)境、不易使病菌產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，因此植物病害的生物防治成為研究熱點(diǎn)[5].

芽胞桿菌具有較廣的抗菌譜，對(duì)多種病原真菌和細(xì)菌均有強(qiáng)烈的抑制作用，生防利用價(jià)值高[6].解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是芽胞桿菌中的一種，能夠產(chǎn)生抗真菌蛋白、表面活性素、伊枯草菌素、幾丁質(zhì)酶等物質(zhì)[7-9].解淀粉芽胞桿菌具有線狀或環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量小，熱穩(wěn)定性好，含有D-氨基酸，能耐受蛋白酶的水解作用，具有無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留、抑菌時(shí)效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)[10]，對(duì)許多危害嚴(yán)重的病原菌都有很強(qiáng)的抑菌活性[11-15]，如對(duì)小麥全蝕病[16]、蔬菜灰霉病[17]及水稻紋枯病[18]等的病原菌均有較好的生物防治作用.有研究表明，解淀粉芽胞桿菌XZ-1 的發(fā)酵液可以抑制甘薯黑斑病病原菌孢子的萌發(fā)，對(duì)菌絲沒(méi)有明顯的致膨大和致畸作用[19]；解淀粉芽胞桿菌SF1103 則可使黃瓜枯萎病病原菌的菌絲和孢子形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重畸形并停止發(fā)育[20].

本研究擬以本課題組自主選育的解淀粉芽胞桿菌菌株HN 為生防菌，采用體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究該菌株對(duì)番茄早疫病、黃瓜枯萎病、黃瓜灰霉病3 種病原真菌的抑制效果，并初步探討解淀粉芽胞桿菌對(duì)病原真菌的抑菌機(jī)理，為解淀粉芽胞桿菌HN 作為生防菌在番茄和黃瓜上的應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 菌種

拮抗菌：解淀粉芽胞桿菌菌株HN 為本課題組分離保存.

病原菌：A，番茄早疫病病原菌（Alternaria solani）；B，黃瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.cucumerinum owen）；C，黃瓜灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）.3 者均來(lái)源于天津市植物保護(hù)研究所.

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，瓊脂15～18 g.

細(xì)菌培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～18 g.

察氏培養(yǎng)基： NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，水1 L.

1.3 病原菌最適培養(yǎng)溫度的篩選

分別在番茄早疫病、黃瓜灰霉病、黃瓜枯萎病3種病原菌的菌落邊緣用打孔器打取直徑為6 mm 的菌餅，將菌餅接種于PDA 平板中央.接種后分別置于25 ℃和30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3 次，每天用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，待長(zhǎng)滿平板時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn).

1.4 HN對(duì)病原真菌的抑制作用

1.4.1 對(duì)峙培養(yǎng)

將HN 以10%的體積比接種于細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，150 r/min、36 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h，汲取100 μL 菌液在細(xì)菌固體平板上涂布，36 ℃下培養(yǎng)24 h，用直徑為6 mm 的打孔器打取菌餅.將病原菌菌餅接種在PDA 固體培養(yǎng)基中央，20 mm 外四周等距接入解淀粉芽胞桿菌菌餅，以不接細(xì)菌菌餅的處理為對(duì)照（CK），每個(gè)處理重復(fù)3 次，置于25 ℃下培養(yǎng).該實(shí)驗(yàn)做2 種不同的處理：一種是拮抗菌與病原菌同時(shí)接于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；另一種是先接拮抗菌于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2 d后再接病原菌.每天采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（d）和拮抗帶寬（Antagonistic bandwidth），待對(duì)照長(zhǎng)滿平板時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，計(jì)算抑菌率（Inhibition rate）.

拮抗帶寬=2 個(gè)接菌點(diǎn)連線上的無(wú)菌區(qū)寬度

抑菌率（%）=（d對(duì)照-d處理）/d對(duì)照×100

1.4.2 牛津杯法

孢子懸液的制備： 將病原菌接種到察氏培養(yǎng)基上，25 ℃下振蕩培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液即為孢子懸液，孢子濃度＞104mL-1.

無(wú)菌濾液的制備：將解淀粉芽胞桿菌菌株HN 接種到液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，36 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)48 h.4 ℃、8 000 r/min 條件下離心20 min，上清液用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾即為無(wú)菌濾液.

在PDA 平板中央分別接種番茄早疫病、黃瓜灰霉病、黃瓜枯萎病的病原菌，在離菌餅對(duì)稱的3 點(diǎn)分別放置1 個(gè)牛津杯，牛津杯中分別加入200 μL 無(wú)菌濾液、發(fā)酵菌液、培養(yǎng)基（滅菌）.放入25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以確定抑菌活性成分存在的部位.

1.4.3 HN 無(wú)菌濾液的添加量對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用平板稀釋法，以1/10、1/20、1/40 和1/80 的體積比將無(wú)菌濾液加入到40～50 ℃的PDA 培養(yǎng)基中，混勻后倒平板，以不加濾液的平板為對(duì)照.凝固后分別將直徑為6 mm 的3 種病原菌菌餅接種到CK、無(wú)菌濾液體積比分別為1/10、1/20、1/40、1/80 的PDA 平板上，每個(gè)處理重復(fù)3 次，放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后測(cè)量菌落直徑.

1.5 HN對(duì)病原菌的抑菌機(jī)理研究

1.5.1 HN對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

在凹形載玻片中滴一滴液體PDA 培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基兩端分別接種病原菌和解淀粉芽胞桿菌HN，CK只接病原菌，蓋上蓋玻片，25 ℃下培養(yǎng)2 d 后，在顯微鏡下觀察菌絲生長(zhǎng)狀況.

1.5.2 HN對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

在凹形載玻片上滴加10 μL 無(wú)菌蔗糖溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%），分別加入10、20、30 μL 的解淀粉芽胞桿菌HN 無(wú)菌濾液，再加入10 μL 的真菌孢子液，使無(wú)菌濾液的體積比分別為1/3、1/2、3/5.其中，黃瓜枯萎病病原菌孢子液稀釋10 倍后添加，番茄早疫、黃瓜灰霉病病原菌直接添加孢子原液.以不加無(wú)菌濾液的處理組為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次.處理后放入加有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋好后放入25 ℃培養(yǎng)箱中，10 h后檢測(cè)孢子萌發(fā)率.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌培養(yǎng)最佳溫度的篩選

3 種病原菌在25 ℃和30 ℃下的生長(zhǎng)情況如圖1所示.由圖1 可以看出，3 種病原菌均是在25 ℃條件下生長(zhǎng)較快，在30 ℃下生長(zhǎng)較慢.其中，黃瓜灰霉病病原菌在25 ℃條件下，培養(yǎng)4 d 后即長(zhǎng)滿平板，而在30 ℃時(shí)幾乎停止生長(zhǎng)；黃瓜枯萎病病原菌25 ℃條件下的生長(zhǎng)速率顯著高于30 ℃下的速率，6 d 后長(zhǎng)滿平板；番茄早疫病病原菌培養(yǎng)至6 d 后，25 ℃和30 ℃下的菌落直徑分別為77.5 mm 和60.0 mm.這些結(jié)果說(shuō)明，25 ℃條件利于上述3 種病原菌的生長(zhǎng)，在后期實(shí)驗(yàn)中，病原菌培養(yǎng)溫度應(yīng)選擇25 ℃.

圖1 不同溫度下病原菌的生長(zhǎng)Fig.1 Fungus pathogens growth under different temperatures

2.2 HN對(duì)真菌的抑制作用

2.2.1 對(duì)峙培養(yǎng)的抑菌效果

HN 分別與番茄早疫、黃瓜灰霉、黃瓜枯萎3 種病原菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，拮抗菌與病原菌同時(shí)接種的微生物生長(zhǎng)情況如圖2（a）所示，具體抑菌效果如表1 所示；先接種拮抗菌，培養(yǎng)2 d 后再接病原菌的微生物生長(zhǎng)情況如圖2（b）所示，具體抑菌效果如表2 所示.

圖2 HN 與3 種病原菌對(duì)峙培養(yǎng)的結(jié)果Fig.2 Results of confrontation cultivation of HN and the three kinds of fungus pathogens

表1 HN 與病原菌同時(shí)接種的抑菌情況Tab.1 Growth inhibition on fungus pathogens by HN under simultaneous inoculation

表2 先接HN 后接病原菌的抑菌情況Tab.2 Growth inhibition on fungus pathogens by HN under inoculation followed by fungus pathogens

由圖2 可以看出，無(wú)論是解淀粉芽胞桿菌HN 與3 種病原菌同時(shí)接種還是先接種HN 后接種病原菌，對(duì)峙培養(yǎng)后，在病原菌與拮抗菌之間均形成了明顯的抑菌帶，拮抗菌HN 周圍產(chǎn)生明顯的抑菌圈，表明HN對(duì)3 種病原菌均有抑制作用.比較2 種接種方式可以看出，先接種HN 后接病原菌其抑菌圈明顯大于同時(shí)接種的抑菌圈.從表1 可以看出，同時(shí)接種時(shí)，HN對(duì)3 種病原菌的抑菌率接近，分別為54%、56%和55%，其中對(duì)番茄早疫病病原菌的拮抗帶寬最大，為2.70 mm，對(duì)黃瓜枯萎病病原菌的拮抗帶寬最小，僅為0.50 mm.從表2 可以看出，先接種HN，培養(yǎng)2 d 后再接種病原菌時(shí)，HN對(duì)番茄早疫、黃瓜枯萎、黃瓜灰霉3 種病原菌的抑菌率分別為77%、67%和81%，拮抗帶寬分別為7.80、3.70 和8.90 mm，顯著高于同時(shí)接種的效果.這可能跟拮抗菌占據(jù)了有利的營(yíng)養(yǎng)空間以及在生長(zhǎng)過(guò)程中分泌的抗菌活性物質(zhì)有關(guān)，這也說(shuō)明HN“防”效果要好于“治”.

2.2.2 牛津杯法的抑菌效果

通過(guò)牛津杯法檢測(cè)HN 的抑菌活性物質(zhì)來(lái)源于菌體細(xì)胞內(nèi)還是細(xì)胞外，結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，解淀粉芽胞桿菌HN 的無(wú)菌濾液和發(fā)酵菌液對(duì)病原菌均有一定的抑制作用，在牛津杯周圍形成明顯的抑菌圈，而且無(wú)菌濾液的抑菌效果與發(fā)酵菌液的抑菌效果相當(dāng)，說(shuō)明抑菌活性物質(zhì)為一種胞外產(chǎn)物.

圖3 HN 不同成分對(duì)3 種病原菌的抑菌效果Fig.3 Inhibition effect of different compositions of HN on the three kinds of fungus pathogens

2.2.3 HN 無(wú)菌濾液添加量對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基中加入不同量的HN 無(wú)菌濾液后，3 種病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖4 所示.

圖4 無(wú)菌濾液添加量對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of dosage of aseptic filtrate on the growth of mycelium

由圖4 可以看出，不同添加量的HN 無(wú)菌濾液作用下，3 種病原菌菌絲的生長(zhǎng)均受到顯著抑制，其效果隨著添加量的增加而增強(qiáng)，在1/10、1/20、1/40 的體積比下其抑菌效果比較接近，抑菌率均達(dá)到80%以上，在1/80 的體積比下抑制作用略有降低，但抑菌率也超過(guò)了75%.HN 無(wú)菌濾液對(duì)不同的病原菌抑制能力有所不同，對(duì)黃瓜灰霉病病原菌的抑制效果最好，在無(wú)菌濾液的體積比為1/10 和1/20 培養(yǎng)基中，黃瓜灰霉病病原菌基本不生長(zhǎng)，連接種的菌絲也慢慢消失，抑制率達(dá)到100%.HN 無(wú)菌濾液對(duì)3 種病原菌的抑菌效果優(yōu)于HN 菌體細(xì)胞，這可能是因?yàn)闊o(wú)菌濾液中的抑菌活性物質(zhì)存在于培養(yǎng)基中，接種病原菌后立即就能發(fā)揮作用，而對(duì)峙培養(yǎng)抑菌活性物質(zhì)來(lái)源于拮抗菌生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，有一定的時(shí)滯.這也解釋了先接拮抗菌后接病原菌的抑菌效果為何優(yōu)于同時(shí)接種.

2.3 HN 的抑菌機(jī)理

2.3.1 HN 菌體對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

HN 菌體作用下，3 種病原菌菌絲的生長(zhǎng)情況如圖5 所示.

圖5 HN 菌體對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響（40×）Fig.5 Effect of HN on the growth of mycelium（40×）

由圖5 可以看出，3 種病原菌正常培養(yǎng)時(shí)，菌絲長(zhǎng)而直，粗細(xì)均勻.而HN 與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)2 d 后，3 種病原菌菌絲的生長(zhǎng)均發(fā)生明顯變化：有的菌絲端部和中部膨大成球狀，菌絲直徑變得較腫大，整個(gè)菌絲變?yōu)槟钪闋睿瑑?nèi)含物清晰可見(jiàn)，最后消失變?yōu)榭瞻?；有的菌絲分枝增多，菌絲出現(xiàn)畸形、彎曲；有的菌絲發(fā)生斷裂.

2.3.2 HN 無(wú)菌濾液對(duì)真菌孢子萌發(fā)的影響

HN 無(wú)菌濾液作用下，3 種病原菌孢子的萌發(fā)情況如圖6 所示，萌發(fā)率如表3 所示.

圖6 HN 無(wú)菌濾液對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用（40×）Fig.6 Inhibitory effect of the aseptic filtrate of HN on spore germination（40×）

表3 病原菌孢子在不同濃度HN 無(wú)菌濾液處理下的萌發(fā)率Tab.3 Spore germination rates of fungus pathogens under the aseptic filtrate of HN with different concentrations %

由圖6 可以看出，經(jīng)HN 無(wú)菌濾液處理后，病原菌的分生孢子或是不能正常萌發(fā)，或是萌發(fā)后孢子較正常萌發(fā)的孢子芽管細(xì)小而短，繼續(xù)培養(yǎng)也無(wú)法正常生長(zhǎng).這說(shuō)明無(wú)菌濾液中的抗菌物質(zhì)對(duì)病原菌孢子有殺滅效果.由表3 可以看出，不同用量的無(wú)菌濾液處理下，番茄早疫病病原菌的孢子基本不萌發(fā)；黃瓜枯萎病病原菌的孢子在1/3 和1/2 無(wú)菌濾液處理下萌發(fā)率比較接近，而在3/5 無(wú)菌濾液處理下萌發(fā)率迅速降為35%；黃瓜灰霉病病原菌的孢子在不同用量無(wú)菌濾液處理下的萌發(fā)率均低于50%，在3/5 濾液處理下萌發(fā)率僅為19%.這些結(jié)果說(shuō)明，HN對(duì)不同病原菌的有效抑菌濃度不同，實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的病原菌選擇合適用量以達(dá)到最佳防治效果.

3 討論與結(jié)論

本研究以解淀粉芽胞桿菌菌株HN 為生防菌，測(cè)試其對(duì)于番茄早疫病、黃瓜枯萎病和黃瓜灰霉病3 種病原菌的抑菌效果.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HN對(duì)于3 種病原菌均有良好的抑制作用.其中，無(wú)菌濾液的體積比為1/80 時(shí)對(duì)3 種病原菌的抑制率均超過(guò)75%，體積比為1/10、1/20 時(shí)無(wú)菌濾液對(duì)3 種病原菌的抑制率均超過(guò)80%，抑菌效果優(yōu)于解淀粉芽胞桿菌MH71 和fqhm-13（MH71 體積比為1/80 的發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜灰霉病的抑制率只有45.39%，fqhm-13 發(fā)酵原液對(duì)黃瓜灰霉病的抑制率為78.1%[21]）.HN 能顯著抑制病原菌的孢子萌發(fā)，無(wú)菌濾液體積比為3/5 處理下番茄早疫病、黃瓜枯萎病和黃瓜灰霉病病原菌的孢子萌發(fā)率分別只有1%、35%和19%.綜上，HN 具有廣譜抑菌活性且抑菌效果突出，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力.

對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，3 種病原菌菌絲均出現(xiàn)膨大、畸形、斷裂、細(xì)胞內(nèi)容物溢出呈空腔等現(xiàn)象，孢子芽管出現(xiàn)畸變、停止發(fā)育現(xiàn)象，推測(cè)解淀粉芽胞桿菌HN 通過(guò)產(chǎn)生抗菌代謝產(chǎn)物抑制病原菌菌絲和孢子的萌發(fā)，從而達(dá)到抑菌效果，這與李曉紅等[21]、羅晶等[16]、陳欣怡[22]、王玉雙等[23]的研究結(jié)果一致.以往研究表明，解淀粉芽胞桿菌的抗菌活性物質(zhì)分為2 類：一類為細(xì)菌素、表面活性素等脂肽類物質(zhì)；另一類為幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等酶類物質(zhì)[24].至于HN 的抗菌活性物質(zhì)具體是什么、能否誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性從而阻止病原菌侵入還有待于進(jìn)一步研究.