膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎誘導(dǎo)性動物模型研究進(jìn)展

沈景壽 張晶 胡毓詩 沈海

1 成都體育學(xué)院（成都610041）

2 四川省骨科醫(yī)院（成都610041） 3 成都第一骨科醫(yī)院（成都610031）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床上影響中老人生活質(zhì)量的慢性關(guān)節(jié)疾病之一。隨著人口老齡化的加劇，KOA的發(fā)病率也逐年上升，耗費(fèi)了巨大的社會醫(yī)療資源。因此，對該病的研究刻不容緩，而建立理想的動物模型是研究KOA 病因病機(jī)的基礎(chǔ)。但是目前可用于該病研究的動物模型不多，缺少對該病動物模型的系統(tǒng)歸納、比較分析。KOA 動物模型主要包括誘導(dǎo)性、自發(fā)性兩種。誘導(dǎo)性動物模型具有實(shí)驗(yàn)用時(shí)短、研究針對性強(qiáng)、成功率高等優(yōu)點(diǎn)。自發(fā)性動物模型由于實(shí)驗(yàn)研究耗時(shí)長，研究結(jié)果不穩(wěn)定，故較少應(yīng)用[1]。

本文以“膝骨性關(guān)節(jié)炎、動物模型、動物造?！睘橹形臋z索詞，以“knee osteoarthritis and animal models or animal modeling”為英文檢索詞，通過萬方、知網(wǎng)、Pubmed 數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)文獻(xiàn)，對國內(nèi)外KOA 誘導(dǎo)性動物模型的建立方法進(jìn)行總結(jié)歸納，為后期KOA 科研提供參考。

1 動物模型的建立

目前國內(nèi)外對KOA 動物模型建立分類的表述方式較多。本文主要從手術(shù)創(chuàng)傷和理化生因素兩方面進(jìn)行表述。其中手術(shù)創(chuàng)傷包括膝內(nèi)創(chuàng)傷與膝外創(chuàng)傷；理化生因素包括物理因素、化學(xué)因素、生物因素。誘導(dǎo)性動物KOA模型建立分類見圖1。

圖1 誘導(dǎo)性動物KOA模型建立分類

1.1 手術(shù)創(chuàng)傷模型

1.1.1 膝關(guān)節(jié)內(nèi)誘導(dǎo)模型

1.1.1.1 傳統(tǒng)Huith法與改良Huith法

傳統(tǒng)Huith 法：切除膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、后交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶以及摘除內(nèi)側(cè)半月板。該法作為KOA經(jīng)典的手術(shù)造模方法，在1970年由Hulth等[2]提出。鄧紫婷等[3]采用Hulth法對模型組的10只大鼠進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后給予抗生素預(yù)防感染7天，造模1周后每天迫使大鼠跑步，每次30 分鐘，跑步維持4 周獲得成功的模型。韋健等[4]采用Hulth 法，術(shù)中關(guān)節(jié)腔內(nèi)滴注慶大霉素抗感染。不固定兔子術(shù)肢，并驅(qū)趕兔子行走30～60 min/d，6 周后出現(xiàn)軟骨缺損，邊緣骨贅形成，成功建立家兔KOA模型。

改良Huith法：在傳統(tǒng)Huith法基礎(chǔ)上稍做改變，完成KOA 動物造模實(shí)驗(yàn)。Candace 等[5]對11 只羊采用改良Huith法剝離內(nèi)側(cè)半月板前角和體部，破壞內(nèi)側(cè)半月板的穩(wěn)定性，出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷、裂縫、侵蝕，甚至骨贅，成功建立KOA 模型。有學(xué)者[6，7]對傳統(tǒng)Huith 法進(jìn)行改良，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)副韌帶，保留了后交叉韌帶；或者摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，保留內(nèi)側(cè)副韌帶與后交叉韌帶。術(shù)后關(guān)節(jié)軟骨破壞，結(jié)構(gòu)紊亂，證明改良Huith 法是建立KOA 動物模型的理想方法。

傳統(tǒng)Huith 法因造模不穩(wěn)定、所需時(shí)間長、造模成功率低等缺點(diǎn)而限制其在臨床上的推廣。改良Huith法較傳統(tǒng)Huith 法復(fù)制時(shí)間短、造模成功率高，臨床上更多應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷后KOA的相關(guān)研究。

1.1.1.2 半月板摘除法

張榮凱等[8]采用手術(shù)方法切除大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶，保留交叉韌帶的完整性，維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，在4周后成功建立了大鼠KOA早期模型，是研究早期KOA 的理想動物模型。祁雷等[9]通過切斷內(nèi)側(cè)副韌帶及內(nèi)側(cè)半月板，建立KOA 模型。術(shù)后4 周觀察到關(guān)節(jié)軟骨面變粗糙、光澤暗淡；術(shù)后6周關(guān)節(jié)軟骨糜爛并伴骨贅生成；術(shù)后8 周關(guān)節(jié)面潰瘍并有大量骨贅形成。研究認(rèn)為通過該方法可以成功復(fù)制KOA 不同時(shí)期的病理特征。

1.1.1.3 關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨劃痕法

關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨劃痕法是通過手術(shù)在膝關(guān)節(jié)軟骨上造成劃痕，破壞軟骨表面結(jié)構(gòu)，造成軟骨損傷的一種實(shí)驗(yàn)方法。段鑫等[10]對比格犬的股骨髁軟骨進(jìn)行刮除，不破壞軟骨下骨，術(shù)后注射抗生素抗感染。術(shù)后16周可見關(guān)節(jié)軟骨明顯缺損，色澤呈暗紅色改變，軟骨缺損部位長入有少許纖維組織，成功達(dá)到了KOA造模效果。

1.1.1.4 前交叉韌帶切斷法

前交叉韌帶切斷法是一種結(jié)構(gòu)破壞少、創(chuàng)傷小、操作簡單的造模方法。劉振龍等[11]采用前交叉韌帶切斷術(shù)，術(shù)中切斷前交叉韌帶并剪掉其2 mm 防止愈合，術(shù)中查Lachman試驗(yàn)、前抽屜試驗(yàn)陽性。術(shù)后抗感染，自由活動。術(shù)后4周表現(xiàn)為軟骨面不光整；術(shù)后6周軟骨面出現(xiàn)輕度糜爛；術(shù)后8周軟骨面糜爛嚴(yán)重，軟骨下骨外露。有研究[12]對豚鼠行單純前交叉韌帶切斷術(shù)造模，術(shù)后給予高頻振動干預(yù)，加速軟骨退變，縮短造模時(shí)間。

1.1.2 膝關(guān)節(jié)外誘導(dǎo)模型

1.1.2.1 關(guān)節(jié)外血循阻斷法

關(guān)節(jié)外血循阻斷法系采用結(jié)扎或切斷關(guān)節(jié)外的血管，阻斷動物下肢大部分的血液回流，造成膝關(guān)節(jié)周圍骨內(nèi)持續(xù)高壓，骨內(nèi)動脈灌注減少，靜脈回流受阻，氧供不足，酸性產(chǎn)物堆積，影響軟骨組織的營養(yǎng)供給，加速軟骨組織的退行性改變。戴七一等[13]采用血管雙重結(jié)扎法結(jié)扎兔子下肢股靜脈、大隱靜脈、臀下靜脈。術(shù)后8 周光鏡可見：軟骨表面局部凹凸不平，缺損及裂隙，軟骨變薄，可見灶性崩解、壞死，潮線部分消失，成功造模。

1.1.2.2 關(guān)節(jié)外應(yīng)力改變法

關(guān)節(jié)外應(yīng)力改變法系一種不侵入關(guān)節(jié)腔，感染幾率低，且創(chuàng)傷小，出血少的造模方法，適合早中期關(guān)節(jié)軟骨病理改變的觀察[14]。

朱鴻飛等[15]通過關(guān)節(jié)外應(yīng)力改變的方法切除實(shí)驗(yàn)兔的雙側(cè)中內(nèi)2/3髕韌帶。術(shù)后1周兔被迫活動，術(shù)后6 周出現(xiàn)早期關(guān)節(jié)退行性改變，術(shù)后8 周表現(xiàn)為中期的病理改變。王勝等[16]采用髕韌帶延長法，通過對術(shù)肢生物力線的改變減輕關(guān)節(jié)壓力，術(shù)后6 周關(guān)節(jié)滑膜增生水腫，術(shù)后12周軟骨層變薄，軟骨面輕度糜爛。

1.1.2.3 卵巢切除法

卵巢切除法是一種通過雌激素對關(guān)節(jié)軟骨的作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)退變的造模方法。王文勝等[17]對模型組采用切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后聯(lián)合上坡訓(xùn)練。術(shù)后8周，單純卵巢切除組可見軟骨基質(zhì)代謝異常，潮線模糊；卵巢切除聯(lián)合上坡訓(xùn)練模型組可見潮線模糊，軟骨裂隙。卵巢切除聯(lián)合上坡訓(xùn)練可高效建立KOA模型。

1.2 理化生因素

1.2.1 物理因素

1.2.1.1 冷凍法

冷凍法系指膝關(guān)節(jié)在寒冷的環(huán)境刺激下，通過關(guān)節(jié)軟骨受損、滑膜水腫充血而誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的方法。林強(qiáng)等[18]采用寒冷刺激聯(lián)合固定的方法制作大鼠KOA模型。將大鼠雙膝置于約4℃的水中，每天在石膏外固定的協(xié)助下維持4 h。造模6 周后髕股關(guān)節(jié)面出現(xiàn)不光滑，關(guān)節(jié)間隙變窄，膝周軟組織腫脹，甚至可見少量骨贅。有研究[19]采用同樣的方法，水溫設(shè)置在6℃，也成功建立了大鼠KOA 模型。通過冷凍刺激大鼠建立KOA 模型，應(yīng)注意預(yù)防動物患肢被凍壞、潰爛感染、缺血壞死等意外發(fā)生。

1.2.1.2 關(guān)節(jié)制動法

通過對模型肢體關(guān)節(jié)外的制動，使骨骼肌萎縮，軟骨細(xì)胞凋亡，形成不可逆的KOA。朱芳曉等[20]采用石膏外固定，患肢制動造模8 周后成功建立KOA 模型。擺雪等[21]采用石膏聯(lián)合鐵絲加固石膏外固定法建立兔KOA模型，固定8周后，成功觀察到KOA的病理組織改變。

關(guān)節(jié)制動法避免了手術(shù)所致創(chuàng)傷性的影響，符合用進(jìn)廢退的自然規(guī)律，符合骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程。但由于長時(shí)間的石膏外固定，易使局部腫脹，嚴(yán)重者出現(xiàn)張力性水泡及皮膚潰爛等并發(fā)癥。因此應(yīng)加強(qiáng)患肢護(hù)理，可考慮在石膏與皮膚之間加用棉墊，并且定期更換，檢查局部皮膚情況，積極預(yù)防并發(fā)癥。

1.2.1.3 異物置入法

研究者向模型膝關(guān)節(jié)內(nèi)置入異物等也可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變，形成骨關(guān)節(jié)炎模型[22]。

1.2.2 化學(xué)因素

1.2.2.1 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射造模方法為目前常用的造模方法，造模周期短，能模擬軟骨破壞的終末環(huán)節(jié)。張紅等[23]于大白兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.6%木瓜蛋白酶溶液0.3 ml，1次/3天，連續(xù)3次。3周后出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨表面較粗糙，局部軟化、潰瘍，滑膜充血水腫等病理改變。張鎮(zhèn)等[24]以2%、5%、10%不同濃度的木瓜蛋白酶和0.03 ml/L L-半胱氨酸混合液注射入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)，2 周后得到不同程度軟骨損傷的KOA 模型。還有多個(gè)研究[25-28]使用不同濃度的木瓜蛋白酶以及與其他化學(xué)物質(zhì)聯(lián)合，在不同動物的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，均成功建立KOA動物模型。

1.2.2.2 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射膠原蛋白酶

Seo 等[29]為了研究電針與阿片類藥物對關(guān)節(jié)炎的止痛效果，采用膠原蛋白誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的方法在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0.05 ml 的4 mg/ml 膠原酶溶液，4 天后加注1 次。4 周后可觀察到類似人類KOA 的病理組織改變。劉軍等[30]總結(jié)了采用膠原酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射的方法建立的KOA 模型。采用Ⅱ型膠原酶以及Ⅲ型膠原酶造模時(shí)，成功造模耗時(shí)短，術(shù)后3 天后可以觀察到KOA的病理改變，縮短實(shí)驗(yàn)周期。

1.2.2.3 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鹽

杜明澤等[31]單次向?qū)嶒?yàn)大鼠的膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入碘乙酸鈉3 mg/50 μl，造模后2 周可形成類似人體KOA病理改變的過程。俞光平等[32]將50 μl 碘乙酸鈉溶液注入大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)誘導(dǎo)KOA 模型，6 周后模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)紊亂、碎裂、軟骨壞死等，成功建立了KOA模型。

1.2.2.4 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿激酶

石輝等[33]于24只大白兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射一定濃度的尿激酶，在誘導(dǎo)后第4、8、12 周分別取兔膝關(guān)節(jié)滑膜組織進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。肉眼觀察結(jié)果顯示：4周滑膜、軟骨無明顯改變；8 周滑膜增生、軟骨變淡黃；12周滑膜增生明顯，軟骨表面粗糙、軟化灶。光鏡觀察結(jié)果顯示：4周出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)；8周出現(xiàn)急性、慢性炎癥并存；12 周出現(xiàn)慢性炎癥修復(fù)。電鏡觀察顯示：12周膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞水腫、壞死、減少，軟骨變薄，軟骨面不光整。

該造模方法誘導(dǎo)處的KOA 癥狀不明顯、時(shí)間周期長，后續(xù)研究較少。這可能與注射尿激酶的濃度以及實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間存在一定關(guān)系，尚有待進(jìn)一步研究。

1.2.3 生物因素——細(xì)胞工程學(xué)造模

于斐等[34]在建立特異性膝骨關(guān)節(jié)炎模型中將高齡小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）基因敲除，成功建立了SIRTl 基因敲除膝骨關(guān)節(jié)炎小鼠動物模型，該項(xiàng)技術(shù)為以后KOA 的研究提供便利條件。通過細(xì)胞工程學(xué)中的細(xì)胞編輯技術(shù)，從基因水平來建立KOA 模型，達(dá)到預(yù)期的造模目標(biāo)，為KOA造模開辟了新路。

2 動物模型的選擇

動物模型的選擇原則為相關(guān)性、適當(dāng)性和實(shí)用性。相關(guān)性是指動物模型的特點(diǎn)和人類疾病的特征存在關(guān)聯(lián)的關(guān)系；適當(dāng)性是指根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵筮x擇合適的動物種類；實(shí)用性是指應(yīng)考慮模型監(jiān)管、來源、維護(hù)條件、費(fèi)用等。兔、鼠價(jià)格相對便宜，并且容易獲得，適用于各類模型的研究，是動物造模首選物種。但羊、狗、猴等費(fèi)用較高，操作相對困難，以及受到實(shí)驗(yàn)倫理的約束，適用度相對較低。

2.1 造模動物種類的選擇

多項(xiàng)研究[35-37]針對KOA 造模的動物種類選擇，歸納總結(jié)了各種動物的優(yōu)缺點(diǎn)，以便研究者基于不同的目的，選擇合適的動物?？偨Y(jié)如表1。根據(jù)目前的實(shí)際情況，我們認(rèn)為使用大鼠或兔來造模，可滿足模型選擇原則，是目前比較符合實(shí)際的建模動物之一。

表1 不同動物造模研究優(yōu)缺點(diǎn)[35-37]

（續(xù)表1）

2.2 模型成功周期的選擇

KOA的動物造模中，造模方式不同，造模成功周期長短不一。不同造模方法的成功周期見表2[17，38]。最快的KOA 成功造模方式為關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物，特別是向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶來建立模型，可達(dá)到多、快、好、省。在造模時(shí)間的控制上，改良Huith法提示，增加患肢的負(fù)荷可以縮短造模時(shí)間。研究者應(yīng)根據(jù)預(yù)期的研究設(shè)置，選擇合適的方法來完成造模。

2.3 模型適用范圍

陳世杰等[39]總結(jié)了各類骨關(guān)節(jié)炎動物模型的適用范圍，見表3。不同的造模方法有不同的研究適應(yīng)范圍，研究者可以根據(jù)預(yù)期的研究目的，選擇合適的造模方法。

表2 不同造模方法的成功周期[17，38]

表3 不同造模方法的適用范圍[39]

3 總結(jié)與展望

本文針對KOA 動物模型的建立方法進(jìn)行總結(jié)歸納，并對不同動物種類模型優(yōu)缺點(diǎn)、不同造模方法的成功周期、不同造模方法的適應(yīng)范圍進(jìn)行歸納。通過分析比較發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)模型的優(yōu)點(diǎn)為造模時(shí)間短，穩(wěn)定性好，當(dāng)前應(yīng)用較廣；但也不可忽視其不足，即存在手術(shù)創(chuàng)傷，不適宜觀察早期KOA 病變和生化代謝方面變化。關(guān)節(jié)外手術(shù)模型避免了關(guān)節(jié)內(nèi)手術(shù)創(chuàng)傷，減少炎癥、出血反應(yīng)的干擾，是觀察KOA 早期病理變化和藥物篩選的理想模型，但目前臨床應(yīng)用較少。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物或化學(xué)物質(zhì)刺激膝關(guān)節(jié)內(nèi)快速形成類似人類KOA 終末期軟骨病理改變，造模時(shí)間短，有別于自然形成關(guān)節(jié)炎和創(chuàng)傷后的關(guān)節(jié)炎，適用于膝關(guān)節(jié)軟骨病理研究，且在藥物防治、療效、篩選等方面有明顯的研究優(yōu)勢，不適合于自發(fā)性或創(chuàng)傷后的骨關(guān)節(jié)炎研究。關(guān)節(jié)制動法和冷凍法符合人類臨床KOA 病理過程。細(xì)胞工程學(xué)的前沿科技手段前景可期，其技術(shù)要求高，資金昂貴，結(jié)果尚不穩(wěn)定，目前較為少用，但作為新興技術(shù)，具有廣泛的發(fā)展前景。