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    基于UHPLC-ESI-HRMS的仿刺參磷脂輪廓產(chǎn)地差異比較

    2019-09-17 06:05:12王雪松張鴻偉張曉梅林黎明徐杰薛長(zhǎng)湖
    關(guān)鍵詞:刺參磷脂產(chǎn)地

    王雪松,張鴻偉,,張曉梅,林黎明,徐杰*,薛長(zhǎng)湖

    (1. 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 青島 266003; 2. 青島海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心, 青島 266000)

    仿刺參(ApostichopusJaponicus)自古以來名列“海八珍”之一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。磷脂(phospholipid,PL)是仿刺參脂質(zhì)組成的重要成分之一,可分為甘油磷脂與鞘磷脂,其基本骨架分別為甘油和鞘氨醇。甘油磷脂是一種兩性分子,一端為親水性的含氮或含磷的頭基,另一端為疏水(親油)性的長(zhǎng)烴基鏈[2]。盡管仿刺參中磷脂相對(duì)于蛋白質(zhì)是低含量組分,但其對(duì)人體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值仍十分可觀[1]。仿刺參磷脂中富含長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(PUFA),如二十碳五烯酸(C20:5 n-3,EPA)和二十二碳六烯酸(C22:6 n-3,DHA),而膳食PUFA中n-3/n-6比例的增加具有降低血漿脂質(zhì)濃度[3],預(yù)防心血管疾病[4],并降低患癌癥風(fēng)險(xiǎn)的作用[5]。

    中國(guó)仿刺參主要產(chǎn)自遼寧、山東和福建等地。市場(chǎng)上大連仿刺參的價(jià)格相對(duì)而言較高,相應(yīng)地也出現(xiàn)了以異地海參冒充遼參高價(jià)出售的現(xiàn)象。為了防止少數(shù)商家進(jìn)行不正當(dāng)牟利,從而保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益,保證水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的平穩(wěn)高速發(fā)展,有必要開展仿刺參的產(chǎn)地溯源研究。目前常見的水產(chǎn)品溯源技術(shù)主要是根據(jù)穩(wěn)定同位素比率、元素分布和生物分子(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))等信息對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行鑒別[6-8]。已有研究利用海參中游離脂肪酸含量差異,通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)地溯源[6],但需要對(duì)脂肪酸進(jìn)行衍生化,操作復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng),此外,氣相色譜難以檢測(cè)不易揮發(fā)的脂質(zhì),具有一定局限性,因此,開發(fā)快速、高通量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法將使其具有更好的應(yīng)用潛力。研究表明,作為重要生物活性脂質(zhì),磷脂的一系列變化反映了生物體內(nèi)代謝的變化,且海產(chǎn)品的磷脂組成會(huì)隨生長(zhǎng)的環(huán)境等條件的不同而變化[9-10]。研究不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓的差異,不僅能夠?yàn)楫a(chǎn)地溯源和營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持,還可為研究外界環(huán)境變化對(duì)仿刺參代謝的影響提供思路和方法學(xué)依據(jù)。

    本研究旨在利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS技術(shù)高靈敏度、高分辨率和高通量的特點(diǎn),采用脂質(zhì)組學(xué)分析策略對(duì)來自3個(gè)產(chǎn)地仿刺參的磷脂分子組成、相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定,并結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)獲取的磷脂組數(shù)據(jù)進(jìn)行信息挖掘,分析確定產(chǎn)地差異分子標(biāo)志物,在磷脂分子種水平探討仿刺參產(chǎn)地鑒別分析的可行性,并進(jìn)一步為其營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)和代謝組學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    于2018年11月分別自大連、膠南及威海3個(gè)不同產(chǎn)地(下文分別簡(jiǎn)寫為DL、JN及WH)的當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場(chǎng)購(gòu)買新鮮仿刺參樣本(體長(zhǎng)約25 cm),去除內(nèi)臟后液氮冷凍,置于-80 ℃暫存。每種仿刺參分別取5個(gè)完整個(gè)體,冷凍干燥后用高速研磨儀(IKA A11basic,德國(guó))于液氮浴中研碎成粉末,保存于50 mL旋蓋離心管中,-20 ℃凍存,分析待用。

    磷脂提取所用三氯甲烷、甲醇和異丙醇均為分析純?cè)噭?gòu)自國(guó)藥(上海)集團(tuán)。流動(dòng)相所用甲醇、乙腈和異丙醇均為質(zhì)譜級(jí)試劑,購(gòu)自美國(guó)Merck公司。超純水采用Milli-Q Gradent系統(tǒng)制備(18.2 MΩ·cm)。甲酸和甲酸銨購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。溶血磷脂酰膽堿(lysophosphocholine,LPC)、磷脂酰膽堿(phosphocholine,PC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphoethanolamine,LPE)、磷脂酰乙醇胺(phosphoethanolamine,PE)、磷脂酰甘油(phosphoglycerols,PG)及磷脂酰肌醇(phosphoinositols,PI)的標(biāo)準(zhǔn)品,純度均>99.1%,購(gòu)自Avanti Polar Lipids公司(Alabaster,USA)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

    主要儀器包括:ShimadzuNexeraX230A超高效液相色譜儀(島津公司,日本);Triple TOF 5600+四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜伙(AB Sciex美國(guó)),配有復(fù)合DuoSpray離子源,應(yīng)用軟件為AnalystTF(版本1.7);DUC-1C氮吹儀(TAITEX公司,日本);ABS35-S精密分析天平(梅特勒-托利多公司,瑞士);CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)(HATACHI公司,日本);A11basic高速研磨儀(IKA公司,德國(guó))。

    1.3實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 樣品前處理

    采用改良型Folch法[11]進(jìn)行磷脂提取。取制備好的仿刺參粉末0.1 g,使用6 mL氯仿/甲醇(2∶1,V/V)振蕩提取10 min,加入2 mL超純水,渦旋20 s,5 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上層至新離心管中(下層氯仿層留置待合并)。向新離心管中加入4 mL氯仿渦旋20 s,靜置5 min,重復(fù)提取2次,合并所有氯仿層提取液,氮?dú)獯蹈扇軇?,并?fù)溶于1 mL的異丙醇/乙腈/水(2∶1∶1,V/V)中,經(jīng)過0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后于-20 ℃儲(chǔ)存,備用。上樣前超聲30 s。

    1.3.2 儀器參數(shù)

    色譜條件:Nexera超高效液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司);C18柱(50.0 mm × 2.1 mm,1.7 μm,美國(guó)ThermoFisher公司)。流動(dòng)相A為甲醇/水(65∶35,V/V),流動(dòng)相B為甲醇/乙腈(20∶80,V/V),A、B相均含1 mmol/L甲酸銨。采用梯度洗脫:0~15.0 min,100% A;15.0~17.0 min,0~80% A;17.0~17.5 min,80%~100% A;17.5~18.0 min,100% A。流速0.5 mL/min,柱溫25 ℃。

    質(zhì)譜條件:Triple TOF 5600+四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(AB Sciex美國(guó));ESI負(fù)離子模式-4.5 kV,離子化溫度500 ℃,霧化氣(GS1)60 psi,輔助加熱(GS2)35 psi;氣簾氣(CUR)15 psi;掃描范圍m/z120~1 000,IDA自動(dòng)二級(jí)掃描模式;進(jìn)樣量10 μL。

    1.3.3 數(shù)據(jù)分析

    使用Lipidview軟件(版本V1.2,美國(guó)AB Sciex公司)中內(nèi)置數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣本中的磷脂輪廓進(jìn)行自動(dòng)鑒定,獲得海參的磷脂輪廓信息。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的特征碎片,對(duì)自動(dòng)鑒定的結(jié)果進(jìn)行人工篩選,過濾除去假陽(yáng)性結(jié)果。通過MS-DAIL軟件(版本V3.12,日本RIKEN研究所),對(duì)海參樣品中檢測(cè)到的磷脂分子種進(jìn)行色譜峰對(duì)齊以及歸一化預(yù)處理,并導(dǎo)入SIMCA-P+軟件(版本V14.0瑞典Umetrics公司)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析,后構(gòu)建正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型,用于尋找不同產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標(biāo)志物。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 仿刺參磷脂組分鑒定

    仿刺參中LPC和LPE保留時(shí)間在4~8 min,PC和PE的保留時(shí)間在8~14 min(圖1)。不同產(chǎn)地的仿刺參在總離子流圖上具有差異,說明其磷脂組成不同;為進(jìn)一步研究造成差異的主要因素,需對(duì)仿刺參中磷脂分子種進(jìn)行鑒定。

    首先對(duì)仿刺參中的磷脂分子種組成進(jìn)行了分析。圖2給出了在負(fù)離子采集模式下3種產(chǎn)地仿刺參中確認(rèn)鑒定的磷脂分子種的質(zhì)荷比-保留時(shí)間二維展開圖。如圖2所示,主要磷脂分子種的洗脫時(shí)間在2~14 min。磷脂分子種的質(zhì)荷比主要集中在400~1 000區(qū)間內(nèi),確認(rèn)了包括PE、LPE、PC和LPC等主要磷脂亞類約160余種磷脂分子種。

    圖1 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂總離子流圖Fig.1 TIC of A. japonicus phospholipids from three geographical origins

    仿刺參中主要磷脂分子種(至少1個(gè)產(chǎn)地的仿刺參中該分子種在其對(duì)應(yīng)磷脂亞類中含量高于5%)總結(jié)于表1。由表可知,仿刺參中磷脂以富含C20∶5、C20∶4和C22∶5等多不飽和脂肪酸的分子種為主,如PC(18∶1-20∶5)、PE(18∶1-22∶5)及PI(18∶0-20∶5)等。而溶血型磷脂(LPC、LPE)中則以飽和或單不飽和中長(zhǎng)碳鏈脂肪酸為主,如LPC(18∶0)、LPE(18∶1)等,與Lou等[12]對(duì)仿刺參脂質(zhì)輪廓分析結(jié)果相一致。不同產(chǎn)地仿刺參中磷脂分子種的相對(duì)含量有所不同,說明磷脂輪廓具有進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分和鑒別的功能。但由于變量數(shù)量較多,利用方差檢驗(yàn)評(píng)估其差異顯著性會(huì)導(dǎo)致不可接受的假陽(yáng)性率(例如,假設(shè)規(guī)定的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.01,則對(duì)于n次檢驗(yàn),存在假陽(yáng)性錯(cuò)誤的概率αn=1-(1-0.01)n,當(dāng)n增加時(shí),αn趨于1[13]),因此宜采用多元統(tǒng)計(jì)模型。

    圖2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子種鑒定Fig.2 Identification of phospholipid molecular species from A. japonicus samples from three geographical origins

    表1 仿刺參中主要磷脂分子種及相對(duì)含量

    Tab.1 Main phospholipid molecular species and their relative abundances inA.japonicasn=5

    磷脂亞類Subclass加合形式Adduct保留時(shí)間/minRetentiontime質(zhì)荷比m/zMass-to-chargeratio磷脂分子種Molecularspecies磷脂相對(duì)含量/%RelativeabundanceofphopholipidDLJNWHPC[M+HCOO]-10.95832.5977PC(16:0-20:5)8.1±0.91.9±0.21.5±0.27.99798.5214PC(18:0-20:5)11.5±1.34.1±0.53.7±0.58.35824.5375PC(18:1-20:4)4.2±0.59.3±1.19.6±1.410.01804.5713PC(18:1-20:5)12.4±1.310.8±1.310.5±1.59.05826.5515PC(18:1-22:6)4.2±0.510.7±1.011.7±4.4PE[M-H]-9.39792.5474PE(18:0-22:5)24.3±1.74.8±0.46.3±0.68.42790.5330PE(18:1-22:5)25.4±2.311.9±0.716.2±1.611.34794.5626PE(20:0-20:4)10.0±1.117.4±2.918.2±2.09.41818.5622PE(20:1-22:5)5.7±0.53.3±1.03.4±1.512.18822.5911PE(22:0-20:4)2.9±0.410.8±2.27.9±1.611.30820.5751PE(22:1-20:4)2.6±0.46.7±1.36.8±1.1PI[M-H]-8.41883.5259PI(18:0-20:5)14.5±2.92.1±0.92.7±0.610.06913.5713PI(20:0-20:4)13.7±2.918.7±4.521.2±6.09.44911.5571PI(20:0-20:5)9.4±2.19.0±2.69.7±3.7

    續(xù)表1,Tab.1 Continued

    注:DL,JN和WH分別表示大連、膠南和威海。下同。

    2.2 仿刺參磷脂輪廓數(shù)據(jù)多元統(tǒng)計(jì)分析

    2.2.1 基于仿刺參磷脂輪廓的聚類分析

    圖3為不同產(chǎn)地仿刺參鑒定的磷脂分子種數(shù)據(jù)PCA-X得分圖。圖中散點(diǎn)間距離表示其在主成分上的差異[14]。如圖3所示,不同產(chǎn)地的仿刺參樣本被分為3類,表明磷脂輪廓能夠?qū)?個(gè)產(chǎn)地的仿刺參有效區(qū)分。大連仿刺參與其他產(chǎn)地的磷脂組成差異較大;同屬山東半島的膠南和威海兩個(gè)產(chǎn)地仿刺參則較為接近,表明其磷脂組成具有相似性。Yun等[15]所產(chǎn)的仿刺參在DNA序列上存在差異。因此,磷脂輪廓的差異一方面可能與其產(chǎn)地環(huán)境因素有關(guān)[16-17],另一方面,也可能受不同產(chǎn)地仿刺參遺傳物質(zhì)差異的影響。生物體內(nèi)脂質(zhì)代謝受生理狀態(tài)等多種因素影響[18],膠南仿刺參個(gè)別樣本超出了PCA-X得分圖的T295%置信區(qū)域,可能是個(gè)體差異導(dǎo)致,不影響后續(xù)分析。

    圖3 3種產(chǎn)地仿刺參PCA-X分析模型的得分圖Fig.3 Score plot of PCA-X model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

    產(chǎn)地溯源技術(shù)的原理是基于不同產(chǎn)地農(nóng)產(chǎn)品光譜特性或化學(xué)組成等方面存在的差異進(jìn)行分析,如張鵬等[19]基于不同產(chǎn)地蘋果中糖分等有機(jī)物含量的差異,利用近紅外光譜技術(shù)建立了有效的產(chǎn)地鑒別模型。目前,已有研究嘗試根據(jù)海參皂苷指紋圖譜進(jìn)行產(chǎn)地溯源,但受個(gè)體差異等多種因素影響,其結(jié)論具有一定局限性[20]。本研究表明,磷脂輪廓可以有效地對(duì)不同產(chǎn)地的仿刺參進(jìn)行區(qū)分,具有進(jìn)一步篩選對(duì)產(chǎn)地差異貢獻(xiàn)較大的磷脂標(biāo)志物的價(jià)值。為了更好地研究不同產(chǎn)地的仿刺參在磷脂輪廓上的差異,需要利用有監(jiān)督作用的多元統(tǒng)計(jì)工具OPLS-DA,對(duì)不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓構(gòu)建模型進(jìn)行分析。圖4給出了仿刺參磷脂輪廓的OPLS-DA模型得分圖,其參數(shù)[R2X=0.889(cum),R2Y=0.979(cum),Q2=0.954(cum)](其中R2X和R2Y分別表示所建模型對(duì)X和Y矩陣的解釋率,Q2標(biāo)示模型的預(yù)測(cè)能力,理論上R2、Q2數(shù)值越接近1說明模型越好,通常情況下,R2、Q2高于0.5 (50%)較好)顯示模型的擬合度和預(yù)測(cè)能力符合要求。如圖4所示,在OPLS-DA模型中樣本類聚度明顯優(yōu)于PCA分析,特別是膠南和威海兩個(gè)產(chǎn)地仿刺參的分離更好,且全部樣本都位于PCA-X得分圖的霍特林T2的95%置信區(qū)域內(nèi),說明該模型對(duì)仿刺參產(chǎn)地的鑒別能力優(yōu)于PCA模型。

    圖4 3種產(chǎn)地仿刺參OPLS-DA分析模型的得分圖Fig.4 Score plot of OPLS-DA model for differentiating A. japonicus samples from three geographical origins

    2.2.2 OPLS-DA兩兩比較及產(chǎn)地差異海參磷脂分子標(biāo)志物的篩選

    聚類分析表明,不同產(chǎn)地仿刺參磷脂輪廓差異顯著。但是,為了篩選對(duì)產(chǎn)地差異具有較大貢獻(xiàn)的分子種(即產(chǎn)地差異的磷脂標(biāo)志物),需進(jìn)一步構(gòu)建OPLS-DA模型進(jìn)行兩兩比較差異分析。表2給出了OPLS-DA模型兩兩比較的質(zhì)量評(píng)估參數(shù)。所有構(gòu)建的OPLS-DA模型在擬合優(yōu)度[R2X(cum),R2Y(cum)]、預(yù)測(cè)能力Q2(cum)、穩(wěn)健度(R2,Q2的回歸曲線截距)方面均滿足要求[21],可以用于產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物的篩選。

    表2 3種產(chǎn)地仿刺參磷脂分子標(biāo)志物篩選OPLS-DA模型質(zhì)量評(píng)估參數(shù)表

    Tab.2 Quality evaluation parameters of OPLS-DA models for differentiating phospholipid molecular biomarkers inA.japonicussamples from three geographical origins

    序號(hào)Number比較組別GroupsR2X(cum)R2Y(cum)Q2(cum)置換檢驗(yàn)回歸曲線截距RegressioncurveinterceptofpermutationtestRb2Qb21DLvsJN0.9310.9990.9990.204-0.6042DLvsWH0.8930.9990.9980.203-0.3483WHvsJN0.5950.9750.9210.321-0.471

    注:回歸曲線截距(Rb2<0.35,Qb2<0.05)時(shí),表示模型穩(wěn)健[22]。

    為保證篩選出的磷脂標(biāo)志物具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,根據(jù)磷脂分子種在OPLS-DA模型中的變量投影重要度(variable importance for the projection,VIP)值、變化倍數(shù)(foldchange)和p值(pvalue)對(duì)結(jié)果進(jìn)行了過濾,并通過載荷圖刀切置信區(qū)間進(jìn)行檢驗(yàn)[23]。最終篩選出10個(gè)磷脂分子種作為產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物(表3),主要是PE和PC。值得注意的是,磷脂標(biāo)志物多篩選自膠南-大連、大連-威海兩組模型,而在威海-膠南模型中則較少,這說明膠南和威海兩個(gè)產(chǎn)地仿刺參磷脂輪組成差異較小,此結(jié)論與PCA聚類分析的結(jié)果一致。在未來研究中,通過表面解吸常壓化學(xué)電離質(zhì)譜等檢測(cè)技術(shù)[24]對(duì)少數(shù)產(chǎn)地差異標(biāo)志物進(jìn)行快速檢測(cè),有望開發(fā)更加高效的仿刺參產(chǎn)地鑒別方法。此外,脂質(zhì)是影響農(nóng)產(chǎn)品感官質(zhì)量和營(yíng)養(yǎng)成分的重要因素[25],本研究篩選的磷脂標(biāo)志物不僅在仿刺參產(chǎn)地溯源方面具有應(yīng)用潛力,也可以作為仿刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)估的重要指標(biāo)。

    表3 仿刺參產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物

    Tab.3 Qualified phospholipid molecular biomarkers ofA.japonicusfrom three geographical origins

    序號(hào)Number分子種Molecular species統(tǒng)計(jì)差異顯著組別Groups with significant difference1LPC(18:0)DL-JN; DL-WH2LPC(20:1)DL-JN3PC(18:0-20:5)DL-JN; DL-WH4PE(22:0-20:4)DL-JN; DL-WH; JN-WH5PE(20:0-20:4)DL-JN; DL-WH6PC(16:0-20:5)DL-JN; DL-WH7PC(18:1-20:4)DL-JN; DL-WH8PE(18:0-22:5)DL-JN; DL-WH9PC(18:1-22:6)DL-JN10PC(18:1-18:2)DL-JN

    3 結(jié)論

    本研究利用UHPLC-ESI-TOF-HRMS分析體系結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析模型,建立了仿刺參磷脂組鑒定分析與產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物篩選方法。PCA分析結(jié)果表明,不同產(chǎn)地仿刺參能夠根據(jù)其磷脂輪廓進(jìn)行有效區(qū)分。通過OPLS-DA模型篩選出10個(gè)產(chǎn)地差異磷脂分子標(biāo)志物(主要是PE和PC),有望進(jìn)一步用于開發(fā)仿刺參產(chǎn)地快速鑒別方法。另外,多不飽和脂肪酸被認(rèn)為是海產(chǎn)品中重要生物活性成分之一,分析發(fā)現(xiàn)篩選的產(chǎn)地差異標(biāo)志物富含C20:4和C20:5等多不飽和脂肪酸,表明不同產(chǎn)地的仿刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可能有所不同。本研究為高值海產(chǎn)品的溯源研究提供了方法學(xué)參考,同時(shí)為評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地仿刺參營(yíng)養(yǎng)價(jià)值差異提供了數(shù)據(jù)支持。

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