胎源性卵巢早衰及宮內(nèi)編程機(jī)制的研究進(jìn)展

龔肖涵，汪暉，徐丹

卵巢是雌性個體的生殖器官，能周期性產(chǎn)生卵子和分泌類固醇激素，在維持機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡及正常生理代謝中發(fā)揮重要作用。近年來卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）在女性中的患病率有上升趨勢，不僅嚴(yán)重影響育齡婦女的生殖健康，還會增加代謝性疾病如骨質(zhì)疏松和心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險。已有報道，女（雌）性卵巢發(fā)育不良及生殖功能異常存在宮內(nèi)起源，胎源性卵巢疾病的發(fā)生與胎兒時期“宮內(nèi)編程”改變有關(guān)[1]。大量流行病學(xué)調(diào)查和動物實(shí)驗(yàn)表明，孕期不良環(huán)境如母體外源毒物/藥物暴露、不良生活習(xí)慣以及母體營養(yǎng)不良和疾病等，不僅影響母體健康，還會對子代的卵巢結(jié)構(gòu)、功能發(fā)育及成年后生殖健康產(chǎn)生不利影響。本文就卵巢發(fā)育的生理調(diào)節(jié)機(jī)制、孕期不良環(huán)境對卵巢發(fā)育的影響及“宮內(nèi)編程”機(jī)制進(jìn)行綜述，旨在加深孕期環(huán)境因素對女（雌）性子代卵巢發(fā)育及功能影響的認(rèn)識，深刻理解卵巢發(fā)育毒性的宮內(nèi)發(fā)育起源，對指導(dǎo)圍生期生活習(xí)慣和臨床用藥均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 卵巢發(fā)育與功能調(diào)節(jié)

1.1 卵巢的結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)育 在胚胎發(fā)生期，原始生殖細(xì)胞（primordial germ cells，PGCs）從卵黃囊通過后腸的背側(cè)腸系膜遷移到生殖嵴，而體細(xì)胞主要來源于生殖嵴的間質(zhì)。生殖細(xì)胞和體細(xì)胞都能在生殖嵴迅速增殖。然后每個生殖細(xì)胞被一層體細(xì)胞包圍形成原始卵泡。原始卵泡形成后聚集在卵巢皮質(zhì)部位，形成原始卵泡庫。卵巢中最主要的生殖內(nèi)分泌單位即為卵泡，屬于不可再生的組織結(jié)構(gòu)。

卵巢的功能是產(chǎn)生雌性配子和分泌類固醇激素。卵巢合成及分泌激素需在多個酶的順序催化下完成。類固醇生成需要將膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到發(fā)生初始類固醇生成反應(yīng)的線粒體，膽固醇由類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR）介導(dǎo)進(jìn)入線粒體，通過細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶（cytochrome P450 cholesterol side-chain cleavageenzyme，P450scc）的聯(lián)合作用轉(zhuǎn)化成孕烯醇酮，進(jìn)一步在系列類固醇合成酶的作用下最終合成性激素（圖1）。

圖1 卵巢類固醇合成酶順序催化下的性激素合成

1.2 卵巢的生理功能調(diào)節(jié)

1.2.1 下丘腦-垂體-卵巢（hypothalamic-pituitaryovarian，HPO）軸的調(diào)節(jié) 下丘腦、垂體和卵巢三個器官組成HPO軸，能發(fā)揮促卵泡發(fā)育、刺激雌激素合成的效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)卵巢的功能發(fā)育[2]。生理情況下，下丘腦脈沖式分泌促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH），刺激垂體分泌卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH），后者分別作用于卵巢相應(yīng)FSH受體（FSHR）和LH受體（LHR），并通過調(diào)節(jié)性激素的產(chǎn)生和釋放，影響女（雌）性生殖系統(tǒng)的發(fā)育。在特定的卵泡發(fā)育期，F(xiàn)SHR和LHR在正確時間點(diǎn)的表達(dá)對促性腺激素（gonadotropins，Gn）成熟和類固醇生成至關(guān)重要，亦是卵巢功能正常發(fā)育和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟。卵巢內(nèi)卵泡啟動生長及始基卵泡池的耗竭過程主要依賴于旁分泌和自分泌的作用，并不依賴于Gn，而進(jìn)入青春期后卵泡的發(fā)育、成熟及閉鎖過程則主要依賴于Gn的刺激作用。FSH是卵泡發(fā)育的主要激素，其可刺激優(yōu)勢卵泡分泌E2。已證實(shí)，F(xiàn)SH可促進(jìn)竇前卵泡及竇狀卵泡的增殖與分化，分泌卵泡液，促進(jìn)卵泡發(fā)育；激活P450arom系統(tǒng)，合成和分泌E2；促使優(yōu)勢卵泡的選擇；誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞表達(dá)LHR[3]。

1.2.2 卵巢局部因子的調(diào)節(jié) 卵巢功能調(diào)節(jié)是一個精密而有序的過程，受環(huán)境、家族遺傳、神經(jīng)內(nèi)分泌、營養(yǎng)代謝等多種因素調(diào)控。卵巢局部調(diào)節(jié)因子對維持其正常功能有重要作用。這些因子由卵巢的卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞產(chǎn)生，可在卵巢局部或通過反饋（即旁分泌）對卵巢功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成員對卵巢具有廣泛的影響。其中，由濾泡細(xì)胞表達(dá)并且涉及卵泡發(fā)育階段的TGF-β超家族成員包括TGF-β、激活素（activin）、生長分化因子9/9B（growth differentiation factor 9/9B，GDF-9/9B）和幾種骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogenetic protein，BMP），通過調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖與分化、各級卵泡的發(fā)育以及激素的合成，來調(diào)控卵巢的發(fā)育[4]。

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）家族包括EGF、肝素結(jié)合EGF樣生長因子（heparin binding EGF-like growth factor，HB-EGF）、TGF-α、表觀蛋白 （epigen，EPGN）、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulins 1，NRG1）、雙調(diào)蛋白（amphiregulin，AREG）、表皮調(diào)節(jié)蛋白（epiregulin，EREG）和β細(xì)胞素（beta cellulin，BTC），都具有高度相似的結(jié)構(gòu)和功能特性。諸多研究證實(shí)，顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞中的EGF樣肽信號傳導(dǎo)對卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟至關(guān)重要，協(xié)調(diào)卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)成熟從而影響卵母細(xì)胞發(fā)育能力[5]。

部分因子能通過修飾Gn對濾泡體細(xì)胞的作用來調(diào)節(jié)卵巢功能，如胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）。IGF分為IGF1和IGF2等多種亞型，其主要的卵巢合成部位為膜細(xì)胞。在膜細(xì)胞上合成的IGF1與顆粒細(xì)胞上的IGF1受體（IGF1R）結(jié)合，從而加強(qiáng)FSH對芳香化酶的激活，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖；還可通過加強(qiáng)LH誘導(dǎo)芳香化酶和3β-HSD表達(dá)從而產(chǎn)生雄激素；亦可通過增強(qiáng)FSH或LH對類固醇生成的影響，直接增加P450scc的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)E2合成和顆粒細(xì)胞增殖。

此外，其他局部因子如激活素、抑制素B（inhibin B，INHB）和卵泡抑素（follistain）對垂體FSH、LH也具有反饋調(diào)節(jié)作用，參與卵巢細(xì)胞增殖、類固醇生成及其在卵泡內(nèi)的活動調(diào)節(jié)等。

2 孕期不良環(huán)境與胎源性POF

POF是指月經(jīng)初潮年齡正?；蚯啻浩谘舆t，第二性征發(fā)育正常的女性，在40歲以前因卵巢內(nèi)卵泡耗竭或卵泡功能障礙而導(dǎo)致的閉經(jīng)現(xiàn)象。臨床表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕、潮熱多汗、性欲下降等低雌激素癥狀。POF對生殖、心理和身體健康會產(chǎn)生諸多不利影響。流行病學(xué)調(diào)查顯示，POF在15～29歲女性中的發(fā)病率為0.1%，在30～39歲婦女中的發(fā)病率為1%[6]，且POF綜合征的廣泛異質(zhì)性使得其準(zhǔn)確的人群患病率可能要遠(yuǎn)高于報道的數(shù)據(jù)水平。

人們?nèi)粘Ｉ钪谐涑庵T多自然和人造物質(zhì)，這些物質(zhì)隨著空氣、飲食進(jìn)入人體。其中一部分有致畸作用的物質(zhì)容易引起研究人員的重視，然而，另一部分可能會遠(yuǎn)期影響性成熟、受孕能力和生殖能力的攝入性物質(zhì)，如尼古?。煵荩⒖Х纫?、乙醇等物質(zhì)的攝入以及部分藥物的濫用等，往往容易被忽視。動物實(shí)驗(yàn)也表明，孕期不良母體環(huán)境會編程子代的生殖發(fā)育，引起子代出現(xiàn)低出生體質(zhì)量和成年后生殖能力早衰等卵巢功能異常。卵巢的卵泡發(fā)生起源于宮內(nèi)時期，因此子代卵巢卵泡的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育與孕期所處環(huán)境密切相關(guān)。有些研究提示POF存在宮內(nèi)起源。

2.1 孕期外源物暴露 越來越多的證據(jù)表明，孕婦暴露于多種外源物如乙醇、咖啡因、尼古丁和某些藥物等會影響胎兒發(fā)育，其中胎兒卵巢發(fā)育也會受到影響。人群流行病學(xué)調(diào)查顯示，孕期不良環(huán)境會引起子代胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR），在出生時表現(xiàn)為低出生體質(zhì)量的女性新生兒，到成年時期表現(xiàn)為較正常人群子宮及卵巢體積明顯減小、FSH分泌過多、排卵率降低或無排卵，提示其卵巢儲備功能下降（diminished ovarian reserve，DOR）[7-8]。美國一項(xiàng)調(diào)查報道，在660名6～11歲的女孩中，分別有19%和39%的母親存在產(chǎn)前吸煙或產(chǎn)前煙霧暴露的狀況。母體產(chǎn)前煙霧暴露的女孩LH和INHB水平顯著降低，證實(shí)產(chǎn)前煙霧暴露對LH和INHB有負(fù)面影響，并可能影響子代卵巢功能[9]。一項(xiàng)丹麥隊(duì)列研究通過追蹤436例在宮內(nèi)暴露于有機(jī)氯污染物的女性子代發(fā)現(xiàn)，雖然月經(jīng)初潮及月經(jīng)周期均未受影響，但卵巢卵泡數(shù)量明顯減少并可能影響成年時期生育力[10]。孕期尼古丁暴露是全球公共衛(wèi)生中最重要的問題之一，可導(dǎo)致多種危害，如子代FGR、心血管疾病發(fā)生等[11]。在吸煙婦女的濾泡液中檢測到尼古丁的代謝產(chǎn)物可替寧[12]，表明尼古丁可以進(jìn)入卵巢、卵泡和發(fā)育中的胚胎并可能產(chǎn)生不利影響。

諸多動物實(shí)驗(yàn)也表明，孕期外源物暴露可影響胎兒卵巢發(fā)育。有研究報道，母體高劑量咖啡因暴露，子代大鼠卵巢質(zhì)量顯著降低，出生后第7～120天的原始卵泡數(shù)和竇卵泡的直徑也顯著降低[13]。研究顯示，孕期暴露于尼古丁的子代小鼠卵巢中卵泡和卵母細(xì)胞減少，卵母細(xì)胞氧化酶水平升高，排卵數(shù)量減少[14]。孕期鄰苯二甲酸酯暴露通過介入卵泡發(fā)生的不同階段破壞卵巢功能并影響卵巢儲備，引起子代POF且具有跨代遺傳的現(xiàn)象[15-16]。孕期地塞米松暴露致子代小鼠胎兒卵巢質(zhì)量降低，各類別卵泡的數(shù)量減少[17]，后期還可能影響子代的生殖能力。發(fā)育源性疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（我室）也證實(shí)，孕期地塞米松暴露不僅對大鼠胎鼠卵巢有發(fā)育毒性作用，此作用還能延續(xù)到成年后，出現(xiàn)POF易感甚至跨代遺傳到子三代[18]。

環(huán)境污染物的孕期暴露對于子代卵巢的功能與發(fā)育也有一定影響。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠孕期暴露于鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（diethyl hexyl phthalate，DEHP）可致雌性子代卵泡數(shù)量降低，雌激素及孕酮水平下降，對其生殖功能具有一定的負(fù)面影響，且具有跨代遺傳效應(yīng)[15-16]。同時，DEHP顯著增加大鼠和小鼠卵巢閉鎖卵泡的數(shù)量，引起POF[19]。大鼠孕期暴露于環(huán)境污染物雙酚A（bisphenol A，BPA）致雌性子代雌激素水平下調(diào)[20]，原始卵泡數(shù)量減少，出現(xiàn)POF的癥狀并具有一定的跨代遺傳效應(yīng)[21]。多種其他環(huán)境污染物如植物雌激素、多氯聯(lián)苯、大豆異黃酮、阻燃劑等的孕期暴露，均被報道可導(dǎo)致雌性子代出現(xiàn)POF的現(xiàn)象。

2.2 孕期母體營養(yǎng)與疾病 母體營養(yǎng)與胎兒健康問題密切相關(guān)，可從不同方面影響胎兒臟器發(fā)育與功能，并介導(dǎo)成年疾病的宮內(nèi)起源。育齡婦女脂肪攝入過多是一個全球性的健康問題。研究顯示，孕期母體高脂飲食誘導(dǎo)豬雌性胎兒卵巢氧化應(yīng)激、凋亡抑制因子表達(dá)降低、卵泡數(shù)量減少和細(xì)胞凋亡增加，易導(dǎo)致子代卵泡池過早耗竭[22]，子代成年后卵泡閉鎖增多，引起POF[23]。同時有研究表明，孕期母體營養(yǎng)不良也會引起胎兒卵巢功能障礙，原始卵泡和顆粒細(xì)胞中的凋亡因子表達(dá)增加、卵母細(xì)胞凋亡增多，對子代成年后生殖功能產(chǎn)生不利影響，出現(xiàn)POF表型[24]。孕期母體低蛋白飲食會導(dǎo)致子代DOR[25]。孕期母體疾病對胎兒發(fā)育也會造成一定影響。有研究顯示，母體妊娠期糖尿病可通過抑制胎兒生長、細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來削弱子代減數(shù)分裂和卵巢發(fā)育，增加卵泡池過度激活和POF的風(fēng)險[26]。

3 胎源性POF的宮內(nèi)編程機(jī)制

3.1 神經(jīng)內(nèi)分泌編程 卵巢發(fā)育受卵巢局部因子的調(diào)控。卵巢局部的IGF1是調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和類固醇合成酶表達(dá)的重要因子。卵巢IGF1信號抑制會導(dǎo)致類固醇合成酶表達(dá)降低和卵巢發(fā)育異常。根據(jù)不同的細(xì)胞類型，IGF1通過作用于IGF1R，進(jìn)而激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和（或）絲裂原激活蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）通路發(fā)揮促細(xì)胞增殖作用。有研究應(yīng)用特異性PI3K或ERK抑制劑，發(fā)現(xiàn)IGF1/IGF1R主要通過PI3K/AKT通路（非MAPK/ERK通路）誘導(dǎo)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞增殖、類固醇合成酶表達(dá)及E2合成[27]。我室的前期研究也證實(shí)，孕期地塞米松暴露可抑制雌性胎鼠卵巢IGF1/IGF1R/PI3K/AKT級聯(lián)通路及細(xì)胞增殖，卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育不良，雌激素合成減少，且這些改變還可以持續(xù)到子三代[18]。

雌激素、糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）、HPO軸等神經(jīng)內(nèi)分泌激素或神經(jīng)內(nèi)分泌軸也在卵巢發(fā)育中發(fā)揮重要作用。通過使用靈長類動物狒狒模型進(jìn)行人類繁殖的研究發(fā)現(xiàn)，胎盤雌激素水平能調(diào)節(jié)胎兒卵巢的卵泡發(fā)育[28]。影響HPO軸的調(diào)節(jié)功能可直接損傷卵巢顆粒細(xì)胞，干擾卵巢性激素分泌，從而導(dǎo)致動情周期和卵泡發(fā)育的異常。據(jù)報道，妊娠期高GC水平可能通過影響胎兒HPO軸發(fā)揮內(nèi)分泌干擾作用，該作用可能通過影響3個層面進(jìn)行：①卵巢性激素（E2、孕酮）的分泌與調(diào)節(jié)；②垂體Gn（FSH、LH）的分泌與調(diào)節(jié)；③下丘腦GnRH的分泌與調(diào)節(jié)。還有研究報道，孕期乙醇暴露致雌性子代HPO軸發(fā)育和功能受到干擾，動情周期和性激素分泌紊亂[29]。孕期母體營養(yǎng)不良也能通過改變HPO軸來編程后代的生殖潛力，出現(xiàn)POF表型。當(dāng)母體暴露于內(nèi)分泌干擾物時，可通過影響類固醇生成基因的表達(dá)，引起神經(jīng)內(nèi)分泌軸中的激素變化，從而導(dǎo)致子代卵泡閉鎖增多[30]。提示母體通過影響子代的神經(jīng)內(nèi)分泌編程而影響子代卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育，甚至出現(xiàn)卵泡閉鎖增加，雌激素水平下調(diào)等POF的病理癥狀。我室研究也發(fā)現(xiàn)，孕期地塞米松暴露對子一代及子三代子代大鼠的血清雌激素水平、卵巢類固醇合成酶均有抑制作用，且FSH水平明顯升高，提示地塞米松可能通過改變子代神經(jīng)內(nèi)分泌編程從而影響卵巢發(fā)育，最終導(dǎo)致POF的跨代遺傳效應(yīng)[18]。

3.2 表觀遺傳修飾異常 表觀遺傳是指DNA序列不發(fā)生改變而基因表達(dá)模式和生物表型卻出現(xiàn)了可遺傳的改變，主要涉及DNA甲基化、微小RNA（microRNA，miRNA）、染色質(zhì)重塑等。已有證據(jù)表明，POF可能受表觀遺傳調(diào)控[31]。隨著每個卵泡被招募到增長的卵泡池中，卵母細(xì)胞建立了相關(guān)的印記模式。若在印記建立過程中暴露于不良環(huán)境，就會破壞其印記模式，伴隨胚胎及胎盤中相關(guān)基因表達(dá)改變和發(fā)育異常[32]。

胚胎早期發(fā)育的兩個階段，配子發(fā)生和胚胎發(fā)生時期均具有較高的DNA甲基化活性。哺乳動物的正常發(fā)育需要DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltansferases，DNMTs）的作用來重新建立和維持基因組內(nèi)的DNA甲基化。DNMTs的表達(dá)水平受到高度調(diào)節(jié)，并在出生后卵巢發(fā)育的特定階段達(dá)到峰值。因此，DNMTs的表達(dá)水平可用于評估卵巢的表觀遺傳狀態(tài)。還有研究發(fā)現(xiàn)，孕期雄激素暴露會導(dǎo)致子代卵巢的異常發(fā)育，黃體數(shù)目減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)與卵泡、女性生殖器和生殖細(xì)胞發(fā)育密切相關(guān)的基因呈現(xiàn)甲基化異常狀態(tài)，如B細(xì)胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma2，Bcl2）基因等。胎兒發(fā)育期間短暫暴露于殺蟲劑甲氧滴滴涕（methoxychlor，MXC）會改變卵巢的甲基化狀態(tài)[33]以及一些特定基因如IGF1的表達(dá)[34]，引起卵巢功能紊亂。生命早期暴露于內(nèi)分泌干擾物對HPO軸相關(guān)基因DNA甲基化和表達(dá)具有終身影響，同時引起生殖衰老[35]。

越來越多的證據(jù)表明，圍生期及孕期生活方式因素，如肥胖或營養(yǎng)不良、吸煙、過量飲酒和攝入咖啡因以及在配子生產(chǎn)過程中使用軟性毒品如搖頭丸等會誘發(fā)子代表觀遺傳改變[36]。胚胎發(fā)育期暴露于不良環(huán)境導(dǎo)致卵巢長期且不可逆變化，卵巢功能基因表達(dá)的表觀遺傳異常可能是其潛在機(jī)制。卵巢含有卵母細(xì)胞和多種體細(xì)胞類型，如顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和卵丘細(xì)胞，其miRNA的表達(dá)和功能與不同細(xì)胞類型相關(guān)，亦與卵巢的功能發(fā)育密切相關(guān)。miR-23a在POF患者血漿中上調(diào)，并且miR-23a過表達(dá)降低X連鎖凋亡抑制蛋白和caspase-3水平，增加人顆粒細(xì)胞凋亡[37]。孕期暴露于BPA也可以調(diào)節(jié)女性胎兒卵巢中的miRNA表達(dá)[38]。已證實(shí)，Kit配體信號傳導(dǎo)對于濾泡組裝和原始卵泡儲備庫的正確建立非常重要[39]。羊暴露于BPA會導(dǎo)致SOX家族基因、kit配體和胰島素相關(guān)基因的miRNA表達(dá)降低[40]，Kit配體的miRNA沉默可能導(dǎo)致卵泡發(fā)生異常，并可以解釋在暴露于環(huán)境雌激素動物中所觀察到的生育力缺陷。我室發(fā)現(xiàn)，孕期尼古丁暴露導(dǎo)致子代卵巢P450arom的H3K9和H3K27乙?；稽c(diǎn)水平降低，出現(xiàn)E2水平下降伴隨細(xì)胞凋亡增加、卵泡閉鎖增多的POF表型[41]。

4 展望

卵巢發(fā)育是一個精密而復(fù)雜的過程，受遺傳、外源物等多種因素的調(diào)控和影響。生活習(xí)慣、社會及心理等諸多因素均能引起POF，并存在多激素、多基因、多機(jī)制的調(diào)控模式。孕期不良環(huán)境不僅會影響母體的健康，更會對其子代卵巢發(fā)育帶來諸多不利的影響。探索已知影響卵巢發(fā)育的調(diào)節(jié)因素與胎源性卵巢疾病的關(guān)系，深入闡明胎源性POF的宮內(nèi)編程機(jī)制，將為解釋胎源性卵巢疾病的發(fā)生提供確鑿證據(jù)，對于深刻理解卵巢發(fā)育異常的宮內(nèi)起源，探尋早期預(yù)警標(biāo)志物和防治靶標(biāo)，均具有一定的理論價值和現(xiàn)實(shí)意義。