泡菜發(fā)酵中不同蒜濃度、pH和鹽度組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)影響的模擬研究

閆鳴霄，吳正云，司育雷，全江龍，張文學(xué)

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院 食品工程系，成都 610065)

泡菜是以新鮮蔬菜為原料，添加適量鹽，經(jīng)自然發(fā)酵或添加外源發(fā)酵劑發(fā)酵的蔬菜制品。泡菜制作中，原料和操作環(huán)境可能帶來包括食源性致病菌在內(nèi)的各種微生物污染[1,2]。大蒜是泡菜制作中的常用輔料，除增加風(fēng)味、改善口感等作用外，還能抑制大腸桿菌等常見食源性致病菌的生長(zhǎng)[3]。泡菜發(fā)酵是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，pH等指標(biāo)隨發(fā)酵的進(jìn)行而改變，此外，發(fā)酵鹽度和溫度在不同的操作中也有較大差異，這些因素都可能對(duì)控制泡菜中大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。目前對(duì)泡菜中大腸桿菌的研究多集中在篩選抑制大腸桿菌的菌株等方面[4,5]，對(duì)影響其生長(zhǎng)的環(huán)境因素探討不多。本研究參考泡菜發(fā)酵過程，通過模擬試驗(yàn)探究大蒜、鹽度、pH、溫度等因素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 菌株

大腸桿菌Escherichiacoli(CICC 10305)。

參考郭永剛等的方法[6]，采用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌株活化與菌懸液制備。

1.2 大蒜提取液制備

新鮮大蒜：購于成都市郭家橋綜合農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。將10 g大蒜搗碎后于50 mL 80%乙醇溶液中萃取24 h，超聲30 min后抽濾，在8000 r/min下離心10 min，取上清液于轉(zhuǎn)速10 r/min、溫度50 ℃下旋蒸濃縮，得到蒜提取液10 mL(濃度1 g/mL)[7]。

1.3 不同大蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合條件下的大腸桿菌抑制試驗(yàn)

選用蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)、pH(4，4.5，5，5.5，6，6.5)、鹽度(1%、2%、3%、4%、5%、6%)和溫度(20，28，37 ℃)4個(gè)因素進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見表1)，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照均勻設(shè)計(jì)表調(diào)整各組培養(yǎng)基以探究大蒜濃度、鹽度、pH、溫度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響。鹽度通過外加氯化鈉、pH用乳酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。培養(yǎng)基經(jīng)121 ℃、20 min滅菌，冷卻后加入蒜提取液。各試驗(yàn)組于對(duì)應(yīng)溫度培養(yǎng)72 h，每隔6 h測(cè)定OD600值[8]，以LB培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)組做3次平行，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。

表1 均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U12(12×62×3)Table 1 Uniform experimental design U12(12×62×3)

1.4 低鹽條件下不同pH和大蒜濃度組合的大腸桿菌抑制試驗(yàn)

確定各試驗(yàn)組均為鹽度2%、溫度28 ℃，對(duì)pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)進(jìn)行組合(共50種組合)。以模擬常見發(fā)酵溫度下低鹽泡菜的發(fā)酵環(huán)境，探究低鹽下大蒜濃度和pH對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律，具體操作同1.3。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Logistic模型擬合大腸桿菌生長(zhǎng)[9]，并考慮生長(zhǎng)延遲期：

當(dāng)t

(1)

式中：X為大腸桿菌的OD600值；X0為t=0時(shí)對(duì)應(yīng)的OD600值；Xmax為最大生物量對(duì)應(yīng)的OD600值；t為生長(zhǎng)時(shí)間，h；td為延遲期，h；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

采用逐步回歸分析蒜濃度、鹽度、pH、溫度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響規(guī)律。

采用Matlab V7.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合；采用SAS V6.12軟件進(jìn)行逐步回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合對(duì)大腸桿菌的影響

在不同蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合條件下，大腸桿菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)明顯不同，見圖1。

圖1 不同蒜濃度、鹽度、pH和溫度組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of different combinations of garlic concentration, salinity, pH and temperature on the growth of E. coli

由圖1可知，在72 h后，7號(hào)延遲期長(zhǎng)于對(duì)照組，但在第2天時(shí)表現(xiàn)出明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。此外，9號(hào)在54 h出現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，提示大腸桿菌生長(zhǎng)未被完全抑制。其余各組對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，生長(zhǎng)量比對(duì)照組減少了94%以上。為探討大蒜濃度、pH、鹽度和溫度等因素對(duì)大腸桿菌的影響規(guī)律，以4個(gè)因素為自變量，大腸桿菌生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)延遲期和最大比生長(zhǎng)速率分別為因變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到如下方程：

Xmax=-0.36-0.13S鹽度+0.19pH，R2=0.516。

(2)

td=88.16+0.46G蒜濃度pH-1.47pH2，R2=0.614。

(3)

式中：Xmax為最大生物量對(duì)應(yīng)的OD600值；td為延遲期，h；S鹽度為鹽度，%；G蒜濃度為大蒜濃度，%。

根據(jù)以上方程，大腸桿菌生長(zhǎng)量受鹽度和pH影響較大。在所研究的范圍內(nèi)，鹽度越高，pH越低，則大腸桿菌生長(zhǎng)量越低，符合楊振泉等[10]、廖春麗等[11]關(guān)于鹽度、pH影響大腸桿菌生長(zhǎng)結(jié)果的報(bào)道。大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期受蒜濃度和pH影響較大。較高的pH下，大蒜濃度對(duì)大腸桿菌的抑制作用更明顯，提示pH可能是影響大蒜抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的主要因素，這可能與蒜的有效抑菌成分大蒜素在pH為 6.5時(shí)具有最強(qiáng)抑菌活性有關(guān)[12]。pH的二次方項(xiàng)表明pH與延遲期存在非線性關(guān)系，當(dāng)pH處于某適中區(qū)間時(shí)，大腸桿菌延遲期達(dá)到極值，而該pH區(qū)間范圍則與蒜濃度有密切的關(guān)系，在考察范圍內(nèi)，pH越低，蒜濃度越高，大腸桿菌延遲期越長(zhǎng)。對(duì)大腸桿菌最大比生長(zhǎng)速率的逐步回歸分析未得到有意義方程(詳細(xì)結(jié)果略)。分析R2值較低的原因在于自變量數(shù)較多，取值范圍較大，逐步分析所得變量之間關(guān)系較為復(fù)雜。

2.2 低鹽條件下不同pH和大蒜濃度組合對(duì)大腸桿菌的影響

由回歸方程(2)、(3)可知，在所考察范圍內(nèi)，溫度對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)影響不大；當(dāng)鹽度較低時(shí)，大腸桿菌將出現(xiàn)更大幅度的生長(zhǎng)。鑒于泡菜低鹽度發(fā)酵的發(fā)展趨勢(shì)[13]，對(duì)2%鹽濃度下不同pH(4.5，5，5.5，6，6.5)和大蒜濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%)組合對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響進(jìn)行了測(cè)試，并采用方程(1)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行擬合獲得參數(shù)(詳細(xì)結(jié)果略)。以pH、蒜濃度為自變量，大腸桿菌生長(zhǎng)量、生長(zhǎng)延遲期和最大比生長(zhǎng)速率分別為因變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到如下方程：

Xmax=2.68+0.64pH-0.01G蒜濃度pH，R2=0.679。

(4)

td=193.54-30.45pH+1.19G蒜濃度pH-0.40G蒜濃度2，

R2=0.715。

(5)

μmax=0.30+0.07pH，R2=0.689。

(6)

式中：μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h-1。

根據(jù)以上方程，2%鹽度下，pH越低，大腸桿菌生長(zhǎng)量越低；生長(zhǎng)量還受蒜濃度和pH的交互作用影響，較高的pH下，大蒜濃度對(duì)大腸桿菌的抑制作用更明顯。由圖2可知，大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期受pH和蒜濃度的影響較大，pH降低能延長(zhǎng)大腸桿菌延遲期；蒜濃度的二次方項(xiàng)表示蒜濃度與延遲期存在非線性關(guān)系，在考察范圍內(nèi)，蒜濃度越高，pH越低，大腸桿菌延遲期越長(zhǎng)；蒜濃度與pH的交互作用說明：相較低pH，高pH下蒜濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)量影響更大；相較高濃度蒜，低蒜濃度下pH對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)量影響更大。此外，pH越低，大腸桿菌最大比生長(zhǎng)速率越低。

圖2 低鹽下蒜濃度和pH對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)延遲期的影響Fig.2 The effect of garlic concentration and pH on the delay period of E. coli under low-salt condition

結(jié)合擬合結(jié)果可知，在pH為5～6.5和低濃度蒜組合條件下，大腸桿菌的延遲期明顯短于對(duì)照組，提示低濃度的蒜可能對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，并且該作用與pH范圍有關(guān)。以大蒜濃度(0%～3%)和pH為自變量，大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期為因變量，進(jìn)行逐步回歸分析，得到如下方程：

td=745.56-237.64pH-15.84G蒜濃度+19.29pH2+7.20G蒜濃度2，R2=0.8067。

(7)

圖3 低鹽下低蒜濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期的影響(pH 6)Fig.3 The effect of low-garlic concentration on the delay period of E. coli under low-salt condition (pH 6)

結(jié)果顯示：在考察范圍內(nèi)，大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期與pH和蒜濃度有關(guān)，且二者與大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期均為非線性關(guān)系且不存在交互作用。根據(jù)方程計(jì)算，當(dāng)pH為6～6.5、蒜濃度為1%左右時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期最短，提示低濃度的蒜對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)pH 為6、蒜濃度為0%～2.1%時(shí)，大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期明顯短于對(duì)照組(見圖3)。類似的情況在甘草、黃芪等[14,15]天然藥材中也有報(bào)道。

結(jié)合泡菜發(fā)酵的環(huán)境因素考慮，在泡菜發(fā)酵，尤其是低鹽泡菜發(fā)酵中，蒜濃度至少應(yīng)大于2%才能發(fā)揮抑菌作用。由于泡菜發(fā)酵微生物種類和環(huán)境因素復(fù)雜，大腸桿菌的生長(zhǎng)情況受到了多方面因素的綜合影響。本研究所選因素有限，分析結(jié)果的精確性受到一定限制，但仍可為進(jìn)一步研究提供參考。

3 結(jié)論

通過模擬試驗(yàn)考察了泡菜發(fā)酵中大蒜濃度、鹽度、pH和溫度等因素對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的綜合影響。結(jié)果顯示：pH和蒜濃度是影響大腸桿菌生長(zhǎng)最主要的因素，其次是鹽度；高鹽低pH下大腸桿菌生長(zhǎng)幅度較?。惠^低pH和較高蒜濃度下大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期較長(zhǎng)。低鹽濃度(2%)條件下，pH和蒜濃度仍是決定大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期的主要因素，相較低pH，高pH下蒜濃度對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)量影響更大；相較高濃度蒜，低蒜濃度下pH對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)量影響更大；最大比生長(zhǎng)速率則主要受pH影響。低鹽(2%)低蒜濃度(0%～4%)下，pH和蒜濃度對(duì)大腸桿菌的延遲期呈現(xiàn)更為復(fù)雜的影響，pH 6～6.5和蒜濃度1%時(shí)大腸桿菌生長(zhǎng)延遲期最短。