外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片生理特性的影響

劉建新，歐曉彬，王金成

(甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅 慶陽 745000)

裸燕麥(AvenanudaL.)是我國丘陵溝壑旱作區(qū)栽培的一種雜糧作物，具有喜陰涼、耐鹽抗旱等生物學(xué)特性，主要分布在西南、西北、華北等地區(qū)的高海拔冷涼地帶，年種植面積約55萬hm2[1]。裸燕麥籽粒不僅蛋白質(zhì)、脂肪和β-葡聚糖等營養(yǎng)成分高，而且還具有控制血糖、血壓和血脂升高的保健功效[2]。然而，裸燕麥種植區(qū)多屬于干旱半干旱少雨地區(qū)，干旱脅迫成為其生長發(fā)育和產(chǎn)量提高的重要限制因子。干旱脅迫下，裸燕麥葉片光合速率下降[3]，活性氧(Reactive oxygen species, ROS)積累導(dǎo)致膜脂過氧化[4]，植株生長發(fā)育受阻和產(chǎn)量下降[5]。因此，探索提高裸燕麥抗旱性的技術(shù)途徑，對減輕裸燕麥旱災(zāi)傷害具有重要意義。

過氧化氫(H2O2)是植物體中一種重要的信號分子，它參與植物防御系統(tǒng)對逆境響應(yīng)的調(diào)控，能夠增強(qiáng)植物對環(huán)境脅迫的耐性[6]。研究表明，H2O2參與了脫落酸誘導(dǎo)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)氣孔關(guān)閉過程[7]，外施H2O2能夠緩解干旱脅迫誘導(dǎo)的活性氧積累對黃瓜葉綠體膜的傷害[8]，提高玉米植株對鹽脅迫的耐性[9]，增強(qiáng)葡萄對低溫[10]和水稻對鎘脅迫[11]的適應(yīng)能力。外源H2O2在燕麥上也有影響種子活力和提高耐鹽性、耐堿性的報道。夏方山等[12]研究表明，高濃度H2O2(3.84 mol·L-1)處理會導(dǎo)致燕麥種子活力的喪失。低濃度(0. 5 mmol·L-1) H2O2則可緩解鹽堿混合脅迫對燕麥種子萌發(fā)和成苗的抑制，且這一過程有Ca2+參與[13]。根部澆灌和葉面噴施H2O2均可通過調(diào)控活性氧代謝和滲透溶質(zhì)積累以及維持K+、Na+平衡，增強(qiáng)燕麥幼苗的耐鹽性[14-15]。外施H2O2通過促進(jìn)脯氨酸合成和抑制其降解提高了鹽堿混合脅迫下燕麥幼苗脯氨酸的含量[16]。堿脅迫下外源H2O2能夠增強(qiáng)燕麥幼苗的活性氧清除能力，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，緩解植株生長的受抑制程度[17-18]。滲透脅迫下膜脂過氧化傷害和光合作用受抑是植物普遍的生理響應(yīng)[3-5，8，14-18]。外施H2O2能夠調(diào)控活性氧代謝，緩解鹽堿脅迫對燕麥幼苗的氧化傷害[14-18]，且H2O2參與脫落酸誘導(dǎo)的植物氣孔關(guān)閉過程[7]。那么，外源H2O2能否通過對受旱燕麥生理響應(yīng)的調(diào)節(jié)，提高燕麥幼苗的抗旱性，目前尚未見研究報道。本試驗(yàn)以白燕7號裸燕麥品種為材料，研究了幼苗葉片光合特性、活性氧代謝和滲透溶質(zhì)積累等生理特性的變化，探討外源H2O2預(yù)處理對干旱脅迫下裸燕麥幼苗生理響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，旨在為應(yīng)用H2O2增強(qiáng)裸燕麥耐旱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)試劑和材料培養(yǎng)

試驗(yàn)于2016年4-7月在甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室日光溫室進(jìn)行。供試30% H2O2為美國Sigma公司產(chǎn)品，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。裸燕麥品種為白燕7號，種子購自吉林省白城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院。將裸燕麥種子在培養(yǎng)箱中25 ℃催芽后選發(fā)芽一致的幼苗播種在盛滿珍珠巖的塑料盆(口徑20 cm，高14 cm)中，置于日光溫室培養(yǎng)，晝溫22～32℃，夜溫16～20℃，相對濕度65%±5%，光照強(qiáng)度400～610 μmol·m-2·s-1，常規(guī)管理。待幼苗二葉一心期時每盆選留長勢一致的壯苗約200株，并澆灌1次1/2 Hoagland營養(yǎng)液300 mL，幼苗長至三葉一心期時進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 預(yù)試驗(yàn)篩選聚乙二醇6000(PEG)和H2O2處理濃度 干旱脅迫：分別用含有PEG 0.0%、11.9%、14.9%、17.8%和20.2%的Hoagland溶液(滲透勢分別為0.0、0.2、0.3、0.4、0.5 MPa)根部澆灌三葉一心期裸燕麥幼苗模擬干旱脅迫，澆灌于每天8∶00進(jìn)行一次，澆灌量250 mL。H2O2預(yù)處理：分別用濃度為0、0.001、0.01、0.1、1、5 mmol·L-1H2O2溶液(加2滴吐溫-80以降低表面張力)對三葉一心期裸燕麥幼苗進(jìn)行葉面噴施，每盆幼苗噴施量約10 mL，待葉片吸收H2O212 h后用含17.8% PEG的Hoagland溶液根部澆灌模擬干旱處理。以上處理每盆作為1個重復(fù)，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。干旱脅迫4 d后測定每盆10株幼苗倒數(shù)第2～3片葉的凈光合速率(Pn)，每盆取0.50 g倒數(shù)第2～3片葉測定丙二醛(MDA)含量，測定重復(fù)3次。

1.2.2 H2O2和PEG交叉試驗(yàn)處理 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)篩選的PEG和H2O2濃度，設(shè)置如下4個處理：CK，蒸餾水噴施三葉一心期裸燕麥幼苗地上部12 h后根部澆灌Hoagland營養(yǎng)液；H2O2處理，用0.01 mmol·L-1H2O2噴施三葉一心期裸燕麥幼苗地上部12 h后根部澆灌Hoagland營養(yǎng)液；PEG處理，用蒸餾水噴施三葉一心期裸燕麥幼苗地上部12 h后根部澆灌含17.8% PEG的Hoagland營養(yǎng)液；H2O2+PEG處理，用0.01 mmol·L-1H2O2噴施三葉一心期裸燕麥幼苗地上部12 h后根部澆灌含17.8% PEG的Hoagland營養(yǎng)液。噴施液中加2滴吐溫-80來降低葉片表面張力，噴施于20∶00進(jìn)行，噴至葉面滴液為限，噴施量每盆約10 mL。根部澆灌于每天8∶00進(jìn)行一次，澆灌量250 mL。每個處理8盆，隨機(jī)排列。根部澆灌處理4 d后取幼苗從上向下數(shù)第2～3片葉測定各項(xiàng)生理指標(biāo)。細(xì)胞膜相對透性和光合參數(shù)取鮮葉直接測定，其它生理指標(biāo)測定用液氮速凍后-70℃低溫冰箱保存材料。根部澆灌處理12 d后處理間植株表型差異明顯，測定植株生長指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 光合色素含量和光合參數(shù) 葉片光合色素含量采用高俊鳳[19]的方法測定。試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天上午(晴)9∶00-11∶00用CIRAS-2光合儀(美國PP Systems公司)測定幼苗葉片凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。采用開放式氣路，紅藍(lán)光源葉室，設(shè)定光合有效輻射為1 000 μmol·m-2·s-1，CO2濃度為400 μmol·mol-1，根據(jù)測定結(jié)果計算光合水分利用率WUE=Pn/Tr。

1.3.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量 分別采用李合生[22]的蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法、茚三酮染色法和磺基水楊酸法測定幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸含量。

1.3.4 植株生長和相對含水量 干旱脅迫12 d后取50株幼苗用直尺測量株高和根長，100株幼苗用自來水沖洗干凈后吸干表面水分稱鮮重，然后在烘箱中105℃殺青30 min，70℃烘干至恒重，稱干重。取20株幼苗采用高俊鳳[19]的方法測定植株相對含水量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有指標(biāo)測定重復(fù)3次，結(jié)果計算均以單位材料鮮重為基礎(chǔ)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析和Duncan法多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG和H2O2處理濃度的確定

與CK相比，11.9% PEG處理裸燕麥幼苗4 d后葉片Pn和MDA含量無顯著變化(圖1)，而14.9%～20.2% PEG處理下Pn顯著下降，MDA含量顯著升高，其中17.8% PEG處理的Pn和14.9% PEG處理的Pn差異不顯著，但MDA含量顯著提高。另外從幼苗表型觀察，11.9%～17.8% PEG處理的幼苗仍保持綠色，而20.2% PEG處理的幼苗萎蔫嚴(yán)重，部分植株葉尖發(fā)黃。因此，本試驗(yàn)選用17.8% PEG作為干旱脅迫的濃度。以 0、0.001、0.01、0.1、1、5 mmol·L-1H2O2噴施預(yù)處理裸燕麥幼苗12 h后根部澆灌17.8% PEG處理4 d，0.01和0.1 mmol·L-1H2O2處理的裸燕麥幼苗葉片Pn顯著高于0 mmol·L-1H2O2的對照(CK)，且兩者的Pn差異不顯著，而兩者的MDA含量顯著低于CK，其中0.01 mmol·L-1H2O2處理降低MDA含量的作用更加明顯；≥1 mmol· L-1H2O2處理的Pn顯著低于CK，MDA含量顯著高于CK(圖2)。因此，H2O2濃度選用0.01 mmol·L-1。

2.2 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片光合色素含量的影響

由表1可知，與CK 相比，干旱脅迫顯著降低了裸燕麥幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b值。外源H2O2顯著提高了干旱脅迫下幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b值，H2O2+ PEG處理的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b值比PEG處理分別提高了20.0%、12.9%、18.5%、8.1%和24.3%。單獨(dú)H2O2處理的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b值與CK無顯著差異。

注：不同字母表示處理間在P<0.05水平差異顯著，下同。 Note: Different letters indicates significant difference at P<0.05 level, the same below.圖1 不同濃度PEG處理對裸燕麥幼苗葉片凈光合速率和丙二醛含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of PEG on net photosynthetic rate and malondialdehyde (MDA) content in leaves of naked oat seedlings

圖2 不同濃度H2O2對PEG(17.8%)模擬干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片凈光合速率和丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of H2O2 on net photosynthetic rate and MDA content in leaves of naked oat seedlings under PEG (17.8%) drought stress

處理Treatment葉綠素aChlorophyll a葉綠素bChlorophyll b葉綠素(a+b)Chlorophyll (a+b)葉綠素a/bChlorophyll a/b類胡蘿卜素CarotenoidCK1.937±0.008a0.533±0.002a2.470±0.006a3.634±0.028b0.425±0.012aH2O21.950±0.028a0.534±0.005a2.484±0.033a3.651±0.023b0.419±0.006aPEG1.265±0.004c0.366±0.005c1.632±0.007c3.454±0.037c0.251±0.007cH2O2+PEG1.581±0.003b0.421±0.005b2.002±0.006b3.758±0.041a0.331±0.013b

注：同列不同字母表示處理間在P<0.05水平差異顯著，下同。

Note: Values followed by different letter within a column are significantly different among treatments atP<0.05 based on the SSR test. The same below.

2.3 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片光合參數(shù)的影響

從表2可見，與CK相比，干旱脅迫下裸燕麥葉片Pn、Gs和Tr顯著降低，降幅分別為32.9%、41.3%和37.8%;Ci提高13.7%,差異顯著；WUE略有提高，但差異不顯著。外施H2O2處理顯著提高了干旱脅迫下的Pn、Gs和Ci，增幅分別為20.6%、25.9%和12.0%，Tr降低9.7%，WUE升高33.8%。單一H2O2處理與CK相比除Gs明顯降低外，對Pn、Tr、Ci和WUE無顯著影響。

2.4 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片活性氧產(chǎn)生和膜脂過氧化的影響

2.5 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片抗氧化防御系統(tǒng)的影響

表4表明，與CK相比，PEG處理的裸燕麥幼苗葉片SOD和POD活性分別提高了93.0%和30.6%，CAT、APX活性和GSH含量分別降低了57.8%、57.6%和24.7%，ASA含量變化不大； H2O2+ PEG處理與PEG處理相比，SOD、POD活性分別下降了21.5%和60.4%，CAT、APX活性和ASA含量分別提高了113.5%、102.9%和13.8%，差異均達(dá)顯著水平，而GSH含量沒有顯著差異。單一H2O2處理與CK相比，顯著降低了CAT、POD和APX活性及GSH含量，降幅分別為19.6%、27.2%、27.8%和35.4%，ASA含量提高了9.4%，差異達(dá)顯著水平，SOD活性則變化不大。

2.6 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由表5可知，與CK相比，PEG處理下裸燕麥幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)含量降低了16.1%，而可溶性糖、游離氨基酸和脯氨酸含量分別提高了79.9%、51.0%和23.9%。 H2O2+ PEG處理與PEG處理相比，可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、游離氨基酸和脯氨酸含量分別提高了10.5%、40.3%、13.8%和17.2%，差異顯著。單一H2O2處理的可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量與CK差異不顯著，游離氨基酸和脯氨酸含量分別提高了34.9%和29.5%。

表2 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

表3 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片丙二醛含量和細(xì)胞膜相對透性的影響

表4 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片中抗氧化防御系統(tǒng)的影響

表5 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.7 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗生長和植株相對含水量的影響

表6表明，PEG處理與CK相比，裸燕麥幼苗株高、根長、鮮重、干重和相對含水量分別降低了23.8%、27.7%、30.6%、26.1%和17.0%。與PEG處理相比， H2O2+ PEG處理的裸燕麥幼苗株高、根長、鮮重、干重和相對含水量分別提高了14.8%、25.0%、20.1%、11.0%和5.93 %，差異顯著。單一H2O2處理的上述指標(biāo)與CK相比均無顯著差異。

3 討 論

3.1 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗活性氧代謝的影響

表6 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗生長和植株相對含水量的影響

3.2 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

積累可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是燕麥適應(yīng)干旱脅迫的重要特征[4]。張波等[29]研究表明，外源H2O2能夠提高鹽脅迫下葉片可溶性糖和GSH含量，從而增強(qiáng)小麥幼苗耐鹽性。本研究結(jié)果顯示，PEG模擬的干旱脅迫下裸燕麥幼苗主要通過增加可溶性糖、游離氨基酸和脯氨酸積累來加強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)，外源H2O2能夠提高干旱脅迫下裸燕麥葉片的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、游離氨基酸和脯氨酸含量。這與外源H2O2可提高NaCl脅迫下燕麥葉片可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖和脯氨酸含量的結(jié)果一致[15]。表明外源H2O2能夠通過提高幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、游離氨基酸和脯氨酸含量來增強(qiáng)受旱裸燕麥的滲透調(diào)節(jié)能力。外源H2O2提高干旱脅迫裸燕麥幼苗游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)含量的原因一方面可能與H2O2能夠增強(qiáng)逆境下脅迫蛋白[26]和抗氧化酶基因表達(dá)[10，27]有關(guān)；另一方面可能是H2O2作為脅迫信號介導(dǎo)外源水楊酸促進(jìn)了干旱脅迫下幼苗對氮素的吸收與同化，從而提高了總氮、游離氨基酸和可溶性蛋白質(zhì)的積累[30]。H2O2能夠提高干旱脅迫下裸燕麥可溶性糖含量可能是因?yàn)镠2O2提高了抗氧化防護(hù)后有效保護(hù)了干旱誘導(dǎo)的活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而提高了光合色素含量(表1)和光合速率(表2)，使糖類物質(zhì)得到積累。脯氨酸不僅是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，還具有穩(wěn)定細(xì)胞膜系統(tǒng)和生物大分子及降低細(xì)胞酸性和清除活性氧的功能，脯氨酸水平的高低通常與細(xì)胞承受的脅迫程度呈正相關(guān)[31]。外源H2O2提高受旱裸燕麥葉片脯氨酸含量的原因可能與H2O2能夠激活鳥氨酸-δ-氨基轉(zhuǎn)移酶和Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶活性，抑制脯氨酸脫氫酶活性有關(guān)[16]。

3.3 外源H2O2對干旱脅迫下裸燕麥幼苗光合作用和植株生長的影響

干旱脅迫下，植物水分代謝失調(diào)導(dǎo)致葉綠體膜結(jié)構(gòu)遭到破壞[8]，葉綠素含量和光合速率降低[3]，植株生長受到抑制[5]。邱宗波等[32]研究發(fā)現(xiàn)，激光預(yù)處理可通過誘導(dǎo)內(nèi)源H2O2產(chǎn)生提高受旱小麥光合色素含量和促進(jìn)植株生長發(fā)育。廖偉彪等報道[33]，外源H2O2可提高3種萱草(Hemerocallis)的葉片相對含水量和氣孔密度，降低氣孔開度。Feng等[34]認(rèn)為內(nèi)源H2O2通過提高葉片的抗氧化能力增強(qiáng)了小麥的抗旱性，而Ishibashi等[35]得出噴施H2O2提高干旱脅迫下大豆葉片含水量是由H2O2促進(jìn)低聚糖生物合成而非氣孔快速關(guān)閉所致。本研究表明，外源H2O2可以緩解干旱脅迫下裸燕麥葉片光合色素含量的降幅，并提高葉綠素a/b和類胡蘿卜素含量。葉綠素a/b反映類囊體的垛疊程度，垛疊程度越高，光抑制作用越弱；類胡蘿卜素具有提高光合效率、吸收剩余光能和清除活性氧的作用[36]。推測外源H2O2有助于保護(hù)受旱裸燕麥葉綠體膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，這與外源H2O2通過提高抗氧化酶活性保護(hù)干旱脅迫下黃瓜葉綠體超微結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致[8]。葉綠體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的維持使干旱脅迫下裸燕麥幼苗光能吸收和轉(zhuǎn)化效率提高，從而有效提高了葉片的Pn。Pn的提高會增強(qiáng)植株光合產(chǎn)物的積累，促進(jìn)植株生長。外源H2O2顯著促進(jìn)干旱脅迫下裸燕麥植株生長和生物量積累(表6)表明，外源H2O2能夠增強(qiáng)裸燕麥幼苗的耐旱性。

干旱脅迫通過氣孔和非氣孔因素使光合作用受到抑制，前者Ci下降，后者Ci提高[37]。本研究中，干旱脅迫導(dǎo)致裸燕麥葉片Pn和Gs同步下降，Ci顯著提高，說明Pn下降主要不是由Gs降低所致，而可能是由于非氣孔因素阻礙了CO2的利用。類囊體垛疊程度降低(葉綠素a/b下降，表1)反映的葉綠體超微結(jié)構(gòu)破壞也佐證了這一點(diǎn)。外源H2O2提高受旱裸燕麥葉片Pn、Gs和Ci說明H2O2主要通過保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)、增加Gs促進(jìn)Pn的提高。水分利用效率(WUE)提高是植物耐旱性增強(qiáng)的重要途徑。外源H2O2處理使干旱脅迫下裸燕麥葉片WUE顯著提高，其原因可能包括兩個方面：一方面外源H2O2提高了干旱脅迫下葉片的Pn，降低了Tr，葉片蒸騰量減少，從而提高了WUE；另一方面外源H2O2提高了干旱脅迫下可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，增強(qiáng)了細(xì)胞保水能力，從而提高了葉片相對含水量，使WUE增大。綜上所述，外源H2O2在維持干旱脅迫下裸燕麥葉片氣孔開放、提高葉片碳同化能力及水分利用效率方面發(fā)揮著重要作用。然而，外源H2O2對干旱脅迫下植物光能吸收、傳遞、耗散和分配的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。需要指出的是本研究是在營養(yǎng)不受限的條件下采用盆栽試驗(yàn)以PEG模擬的干旱脅迫下白燕7號這一裸燕麥單一品種對外源H2O2的生理響應(yīng)特征，試驗(yàn)條件與大田實(shí)際的生產(chǎn)條件有較大差異。因此，還需進(jìn)一步采用大田控水試驗(yàn)探討外源H2O2對不同抗旱性裸燕麥品種生理響應(yīng)的調(diào)控機(jī)理。