連翹敗毒丸高效液相色譜指紋圖譜研究及聚類分析

許 翔

（中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建 福州 350000）

連翹敗毒丸由連翹、金銀花、黃連、黃芩、黃柏、赤芍等19味中藥材組方，有清熱解毒、散風(fēng)消腫功效，臨床主要用于治療臟腑積熱與風(fēng)熱濕毒引起的瘡瘍初起、紅腫疼痛、憎寒發(fā)熱、風(fēng)濕疙瘩、遍身刺癢、大便秘結(jié)[1]。本研究中建立了連翹敗毒丸的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析，為其質(zhì)量控制和快速評(píng)價(jià)提供借鑒?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司，包括在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD-G1314C型檢測器、Chemistation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；AUW-220D型十萬分之一電子天平（日本島津公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 試藥

連翹苷對(duì)照品（批號(hào)為 110821-201816，含量95.1%），連翹酯苷A對(duì)照品（批號(hào)為111810-201707，含量97.2%），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753-201817，含量96.8%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-201821，含量95.4%），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201814，含量 86.7%），漢黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為112002-201702，含量98.5%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201842，含量97.4%），均購于中國食品藥品檢定研究院；連翹敗毒丸（承德天元藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為 171019，171222，180126，180222，180319，180408，180513，180619，180910，181021，181107，181126，編號(hào)為 S1 ～ S12，規(guī)格為每袋 9 g）；乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2-3]

色譜柱：YMCHydrosphere-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5% 磷酸溶液（B），梯度洗脫 （0～16 min、16%A→25%A，16～30 min、25%A→38%A，30～40 min、38%A→59%A，40～54 min、59%A→80%A，54～62 min、80%A→16%A）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：328（0～16 m），220 nm（16～40 min），277 nm（40 ～62 min）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：分別稱取連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷的對(duì)照品各適量，精密稱定，以甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為 2.245 6，2.001 7，1.113 4，0.582 7，0.511 9，1.201 2，0.894 1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，冷藏避光保存。

供試品溶液：取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物，研細(xì)，取約2.5 g，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加入30 mL甲醇溶液，室溫超聲（功率450 W，頻率40 kHz）處理40 min后取出，放冷，用甲醇定容，搖勻，濾過，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

方法學(xué)考察：按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于2%，表明儀器精密度、方法重復(fù)性良好，供試品溶液室溫放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

指紋圖譜的建立及相似度分析：取12批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定，得HPLC圖譜，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版）軟件，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1和圖2。S1～S12號(hào)樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度分別為0.989，0.971，0.967，0.992，0.909，0.981，0.988，0.974，0.979，0.994，0.993，0.989，均大于 0.9。在 23 個(gè)共有峰中，12號(hào)峰的面積最大，峰位居中，分離完全，通過與混合對(duì)照品圖譜對(duì)照，指認(rèn)出其為連翹苷，設(shè)為參照峰（S），計(jì)算其他共有峰對(duì)12號(hào)峰的相對(duì)峰面積。詳見表1。

圖1 12批樣品HPLC疊加指紋圖譜

圖2 樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜

共有峰指認(rèn)：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版）對(duì)12批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行比較分析。結(jié)果，可指認(rèn)23個(gè)共有峰中的7個(gè)成分，分別為綠原酸（3 號(hào)峰）、芍藥苷（8 號(hào)峰）、連翹苷（12 號(hào)峰）、連翹酯苷A（14號(hào)峰）、鹽酸小檗堿（15號(hào)峰）、黃芩苷（19號(hào)峰）、漢黃芩苷（20號(hào)峰）?；旌蠈?duì)照品色譜圖見圖3。

2.4 聚類分析[4-5]

將12批樣品中23個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積數(shù)據(jù)輸入SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用組間均聯(lián)法，以歐氏距離平方為測度，采用系統(tǒng)聚類分析法進(jìn)行模式識(shí)別分析，結(jié)果見圖4。根據(jù)聚類分析樹狀圖，當(dāng)類間距介于15～25時(shí)，12批樣品被分成了 3大類：S4、S10、S11為一類，S1、S2、S3、S6、S7、S8、S9、S12 為一類，樣品 S5 單獨(dú)為一類。聚類分析結(jié)果與相似度結(jié)果基本一致。

3 討論

現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)連翹敗毒丸的性狀、大黃的薄層和丸項(xiàng)下的通則檢查做了規(guī)定，難以全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量，文獻(xiàn)報(bào)道鮮有對(duì)其綜合質(zhì)量的評(píng)價(jià)方法[6]。在中醫(yī)藥理論中，中成藥的藥效是各味藥發(fā)揮協(xié)同作用的結(jié)果，指紋圖譜可全面控制中藥內(nèi)在化學(xué)成分的整體質(zhì)量，它是以色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積來進(jìn)行定性，以色譜峰面積進(jìn)行定量，可作為分析中藥內(nèi)部有效成分的技術(shù)[7-8]。

本研究中以12號(hào)峰（連翹苷峰）為參照峰，計(jì)算得的12批樣品23個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.05% ～1.10%（文中表略），均較??；而相對(duì)峰面積的RSD為 0.06% ～4.72% ，其中 7，18，21，23 號(hào)峰大于2.0%，峰面積的差異可能與原料藥材質(zhì)量有關(guān)，不同產(chǎn)地和來源的藥材質(zhì)量有很大差異，建議藥廠在選藥投料生成前應(yīng)注意藥材成分含量的檢測。

本研究中曾采用二極管陣列檢測器行全波長掃描，為了實(shí)現(xiàn)連翹苷、連翹酯苷A、綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿、芍藥苷的同時(shí)測定，采用不同時(shí)段切換不同檢測波長：0～16 min時(shí)，在328 nm波長處測定綠原酸；16～40 min時(shí)，在220 nm波長處檢測連翹苷、連翹酯苷A及芍藥苷；40～62 min時(shí)，在277 nm波長處檢測黃芩苷、漢黃芩苷、鹽酸小檗堿。同時(shí)比較了乙腈和甲醇作為有機(jī)相，0.1%磷酸溶液、0.3%磷酸溶液、0.5%磷酸溶液及水作為無機(jī)相的檢查效果，結(jié)果表明，以乙腈-0.5%磷酸溶液系統(tǒng)得到的指紋圖譜色譜峰數(shù)量多、信號(hào)強(qiáng)、分離效果好。研究過程中還比較了超聲提取、加熱回流提取及浸漬過夜提取3種提取方法的差異，結(jié)果提取率無明顯差異，但超聲提取時(shí)間短、操作簡便，故為了節(jié)約成本采用超聲提取法。

綜上所述，本研究中建立了連翹敗毒丸HPLC指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其多指標(biāo)成分整體、綜合的客觀評(píng)價(jià)與分析，共識(shí)別出23個(gè)共有峰，并指認(rèn)出其中7個(gè)指標(biāo)性成分，能較好地反映出連翹敗毒丸內(nèi)在質(zhì)量信息，可為有效控制連翹敗毒丸的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

表1 12批藥材樣品HPLC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

圖3 混合對(duì)照品溶液HPLC圖

圖4 12批樣品聚類分析樹狀圖