從氧化炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)角度探討淫羊藿素對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用*

陳建寧，劉國(guó)祥，汪文略，葉嘉民，楊宇博，彭燕婷，陳 浩，顧喬喬，黃志華，黎 曉

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.2016級(jí)本科生；2.2015級(jí)本科生；3.2017級(jí)本科生；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

急性心肌梗死是當(dāng)前全世界死亡的主要原因之一，臨床上采用的各種介入治療和溶栓治療手段在恢復(fù)血液灌流及氧供應(yīng)的同時(shí)，?？蓪?dǎo)致缺血區(qū)域活性氧(ROS)的大量釋放，從而進(jìn)一步加重心肌損傷，形成心肌缺血再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI)[1]。心肌缺血再灌注損傷機(jī)制復(fù)雜，涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡和自噬等多方面[2-6]，其中體內(nèi)氧自由基大量產(chǎn)生并堆積而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是最重要的機(jī)制之一[7]。文獻(xiàn)表明，I/R可以通過(guò)黃嘌呤氧化酶NAPDH氧化酶系統(tǒng)、線粒體電子傳遞酶鏈和一氧化氮合酶解偶聯(lián)等產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)[8]，后者可作為第二信使介導(dǎo)諸如炎癥反應(yīng)[9]等的發(fā)生。另有研究稱，活性氧的增加是炎癥小體活化的關(guān)鍵因素[10]。因此，調(diào)節(jié)活性氧的釋放繼而調(diào)節(jié)抗炎和抑炎因子的平衡，即調(diào)控氧化炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)可達(dá)到保護(hù)損傷組織的作用。

淫羊藿素(Icaritin, ICT)，是淫羊藿苷的代謝產(chǎn)物，屬于植物雌激素類化合物，在骨質(zhì)代謝、心血管系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)等方面具有廣泛的生物活性[11]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，ICT可以對(duì)MIRI大鼠發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷和抗炎作用[12]。為了進(jìn)一步明確ICT保護(hù)心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈后再通的方法，構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)經(jīng)淫羊藿素治療后，各組大鼠心肌組織或血清中氧化應(yīng)激性指標(biāo)及炎癥因子IL-1β的變化情況，從氧化炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)角度闡述其可能的作用機(jī)理，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性SD大鼠40只，體重250～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物中心許可證：SCXK(湘)20160002，動(dòng)物合格證號(hào)：43004700048216，級(jí)別：SPF級(jí)]。

1.2試劑及藥物淫羊藿素(C21H20O6)，分子量為368.38，黃色粉末，由上海天習(xí)化工有限公司提供，純度99%以上，使用時(shí)采用二甲基亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)溶解。DMSO購(gòu)自Sigma公司(貨號(hào)：T887725G)。氧化應(yīng)激檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其中包括SOD試劑盒(貨號(hào)：A001)、GSH-Px試劑盒(貨號(hào)：A005)、MDA試劑盒(貨號(hào)：A0031)。 ELISA試劑盒(購(gòu)自R&D Systems，貨號(hào)：RLB00)；HE染色試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自invitrogen公司，貨號(hào)：C28025)；SYBR?Select Master Mix: Life technologier(貨號(hào)：4472908)；引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組與給藥實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只：假手術(shù)組(腹腔注射等劑量的DMSO)、I/R損傷模型組(腹腔注射等劑量的DMSO)、ICT低、中、高劑量治療組(腹腔注射，劑量分別為0.5 mg·kg-1、1 mg·kg-1、2 mg·kg-1)。

1.3.2大鼠I/R損傷模型的制備大鼠腹腔注射后，仰臥固定，行氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)(潮氣量4 mL·100 kg-1，呼吸頻率60次/min，呼吸比1.2∶1)，調(diào)整至大鼠呼吸起伏與呼吸機(jī)頻率一致。肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測(cè)，連續(xù)記錄。在胸骨左緣第3～4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，打開(kāi)心包；于肺動(dòng)脈圓錐及左心房間找出冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)，并用無(wú)創(chuàng)縫合針6/0絲線于LAD下穿過(guò)，完成結(jié)扎。缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)：肉眼可見(jiàn)結(jié)扎線下心臟左室壁變暗變紫, 心尖部變白, 心電圖示ST段明顯上抬 (>0.25 mV) ;缺血45 min后, 剪斷結(jié)扎線, 恢復(fù)心肌供血, 再灌注60 min。再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn):左心室和心尖部變紅潤(rùn)、ST段回落。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，其他操作與模型組同。

1.3.3心肌組織生化指標(biāo)測(cè)定再灌注60 min后，取心肌組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書使用酶標(biāo)儀測(cè)定SOD、GSH-Px、MDA。

1.3.4HE染色再灌注結(jié)束后，取心肌組織固定脫水、石蠟包埋、切片，按HE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行HE染色操作，觀察心臟病理學(xué)改變。

1.3.5ELISA檢測(cè)IL-1β含量再灌注結(jié)束后，取心肌組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書使用酶標(biāo)儀測(cè)定IL-1β水平；經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，按照試劑盒說(shuō)明，測(cè)定血清IL-1β水平。

1.3.6Realtime-PCR方法檢測(cè)IL-1βmRNA表達(dá)再灌注結(jié)束后，取心肌組織勻漿，用TRIzol提取總RNA, 酶標(biāo)儀測(cè)定總RNA的濃度和純度，并按照說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄操作，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。q PCR體系：cDNA 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 min，PCR反應(yīng)，95 ℃變性10 s，61 ℃退火20 s，72 ℃延伸25 s，共40個(gè)循環(huán)。見(jiàn)表1。

表1 IL-1β， GAPDH，β-actin 引物序列

2 結(jié) 果

2.1ICT對(duì)MIRI大鼠GSH-Px、SOD、MDA的影響如圖1所示，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠組織GSH-Px活力降低(P<0.05)、SOD活力顯著下降(P<0.01)、MDA含量上升(P<0.05)；1 mg·kg-1ICT治療后大鼠心肌組織GSH-Px、SOD活力升高(P<0.05)、MDA含量下降(P<0.05)，提示1 mg·kg-1ICT治療效果更好。

注：與假手術(shù)組相比*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比# P<0.05。

2.2ICT對(duì)MIRI大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響如圖2所示，假手術(shù)組心肌組織未見(jiàn)明顯的病理改變，橫紋較清晰，呈正常態(tài)；I/R組大鼠心臟組織病理學(xué)改變明顯，心肌間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(箭頭所指處)，部分心肌細(xì)胞變性、壞死，肌束排列不整齊，出現(xiàn)收縮帶，并可見(jiàn)肌絲斷裂溶解態(tài)；ICT治療后各組肌束紊亂程度有所降低，心肌纖維排列較整齊，呈長(zhǎng)條形，心肌細(xì)胞部分輕度腫脹，且間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，損傷程度明顯改善。

圖2 淫羊藿素對(duì)MIRI大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)的影響

2.3ICT對(duì)MIRI大鼠心肌組織或血清中IL-1β的影響如圖3所示：相比較于假手術(shù)組，模型組中IL-1β mRNA水平上升(P<0.05)；相比于模型組，ICT治療后降低IL-1β mRNA水平(P<0.05)和血清IL-1β含量(P<0.05)，而對(duì)組織中IL-1β含量變化不明顯。

注：與假手術(shù)組相比*P<0.05；與模型組相比# P<0.05。

3 討 論

心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞代謝異?？蓪?dǎo)致琥珀酸的大量積累，并于再灌注時(shí)迅速氧化，最終導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生[13]，活性氧隨后開(kāi)放線粒體(m PTP)孔，通過(guò)放大級(jí)聯(lián)效應(yīng)造成更多ROS的釋放[14]，后者可經(jīng)GSH、SOD等清除，故檢測(cè)GSH、SOD等相關(guān)抗氧化酶類物質(zhì)的含量往往可作為觀測(cè)活性氧的傷害程度[15]。在再灌注期，伴隨一種自相矛盾的組織反應(yīng)，可促進(jìn)活性氧和氮物質(zhì)的產(chǎn)生，并促進(jìn)缺血組織中促炎性免疫細(xì)胞的螯合，能快速誘導(dǎo)多種炎癥因子，包括IL-1β、IL-18和TNF-α等釋放，進(jìn)而放大組織損傷，這已被廣泛認(rèn)可是心肌缺血再灌注損傷的主要機(jī)制之一，目前受到眾多學(xué)者的關(guān)注。大量研究表明，ROS介導(dǎo)了經(jīng)典炎癥信號(hào)通路的發(fā)生，其介導(dǎo)作用可能與TLR4或NF-KB信號(hào)有關(guān)，可進(jìn)一步造成IL-1β、TNF-α的上調(diào)，從而加重炎癥反應(yīng)；當(dāng)使用了ROS清除劑后，炎癥的損傷作用隨即減輕[16]，這些結(jié)果均提示ROS是炎癥產(chǎn)生的重要調(diào)控因素。此外，在抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究中，平鍵等發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能抑制NF-KB活化及核轉(zhuǎn)位抑制肝纖維化[17]，提示淫羊藿苷可能參與了炎癥路徑的調(diào)控。

因此，為了探究淫羊藿素(ICT)治療心肌缺血再灌注損傷大鼠的作用機(jī)制，我們采用了多種方法檢測(cè)了相應(yīng)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICT能提高心肌組織中GSH、SOD的活性，并下調(diào)MDA的含量；同時(shí)，HE染色結(jié)果也顯示，ICT可有效改善心肌缺血再灌注后大鼠心肌細(xì)胞的變性壞死，降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這些證據(jù)證實(shí)了zhang等[18]的觀點(diǎn)：ICT可能通過(guò)降低活性氧，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，并最終保護(hù)心肌組織免受損傷。同時(shí)，我們采用RT-PCR方法檢測(cè)了ICT對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織中IL-1βmRNA表達(dá)的影響，結(jié)果表明，ICT能夠有效降低IL-1βmRNA的表達(dá)，進(jìn)一步運(yùn)用ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了實(shí)驗(yàn)各組大鼠心肌組織及血清中IL-1β的含量，結(jié)果顯示，ICT明顯降低其IL-1β的含量。

綜上，ICT可能通過(guò)抑制MIRI大鼠氧化性損傷及炎癥反應(yīng)帶來(lái)的級(jí)聯(lián)效應(yīng)發(fā)揮保護(hù)心肌的作用，其機(jī)制可能與活性氧(ROS)促進(jìn)缺血組織中促炎細(xì)胞的螯合，誘導(dǎo)炎癥因子的釋放，進(jìn)而放大組織損傷有關(guān)，這種由炎性損傷帶來(lái)的細(xì)胞死亡，被稱作為細(xì)胞焦亡(pyroptosis)，是新近研究發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細(xì)胞死亡方式，這或許為今后對(duì)MIRI的干預(yù)研究帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)，我們擬于下一步繼續(xù)探討。