臨床實(shí)驗(yàn)室對定量檢測產(chǎn)品精密度的評(píng)價(jià)

郭 綺

(重慶市藥品技術(shù)審評(píng)認(rèn)證中心，重慶 401120)

臨床檢驗(yàn)中對患者樣本一般進(jìn)行一次測量，體外診斷(IVD)試劑的精密度符合要求才能保證臨床結(jié)果的準(zhǔn)確性，好的精密度是獲得良好準(zhǔn)確度的先決條件[1]。精密度主要由測量過程中的隨機(jī)誤差和一些變異因素(如試劑批次、校準(zhǔn)周期、校準(zhǔn)品批次、儀器、操作者等)所引起，針對不同的引起精密度變化的因素進(jìn)行考察，可得到不同類型的精密度，如批內(nèi)精密度、批間精密度等[2-3]。精密度是IVD試劑、儀器的重要分析性能之一，是產(chǎn)品研發(fā)、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)制訂、產(chǎn)品注冊等過程的重要技術(shù)指標(biāo)，其評(píng)價(jià)資料是評(píng)價(jià)擬上市產(chǎn)品有效性的重要依據(jù)，也是產(chǎn)品注冊所需的重要申報(bào)資料之一[3-4]。所以精密度在IVD定量檢測產(chǎn)品研發(fā)階段就應(yīng)該受到廠家研發(fā)人員的重視。

精密度作為檢驗(yàn)項(xiàng)目分析性能參數(shù)中最重要的性能指標(biāo)之一同時(shí)也是醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室ISO 15189質(zhì)量管理體系要求的項(xiàng)目，受到臨床實(shí)驗(yàn)室的高度重視[5]。目前，國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室主要依據(jù)WS/T 492-2016 《臨床檢驗(yàn)定量測定項(xiàng)目精密度與正確度性能驗(yàn)證》標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]，該標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)CLSI EP 15-A文件[4,6]。隨著近幾年國內(nèi)IVD行業(yè)的迅速發(fā)展以及臨床實(shí)驗(yàn)室對IVD定量檢測產(chǎn)品精密度驗(yàn)證活動(dòng)的不斷實(shí)踐和加深認(rèn)識(shí)[7]，國家審評(píng)中心、行業(yè)、臨床實(shí)驗(yàn)室對IVD定量檢測產(chǎn)品的質(zhì)量要求也在不斷提高。筆者依據(jù)新版美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) EP15-A3文件“用戶對精密度驗(yàn)證和偏倚評(píng)估”，編制了臨床實(shí)驗(yàn)室定量測量項(xiàng)目精密度驗(yàn)證程序，旨在為臨床實(shí)驗(yàn)室IVD定量檢測產(chǎn)品精密度驗(yàn)證的實(shí)施提供參考。

1 精密度驗(yàn)證方法

1.1方法簡介 實(shí)驗(yàn)主要是在5個(gè)工作日內(nèi)重復(fù)檢測同一批樣本，共5次。如需要達(dá)到更可靠的穩(wěn)定性，則建議增加實(shí)驗(yàn)時(shí)間[6]。

1.2準(zhǔn)備工作

1.2.1熟悉期 (1)人員培訓(xùn):工作人員應(yīng)學(xué)會(huì)儀器操作，維護(hù)程序，樣本準(zhǔn)備方法，測量系統(tǒng)校準(zhǔn)和校準(zhǔn)驗(yàn)證功能，必要時(shí)由廠家提供培訓(xùn)。(2)質(zhì)控程序：在熟悉期就應(yīng)該建立該方法的質(zhì)控程序。根據(jù)廠家說明書，確認(rèn)儀器操作在控，可使用廠家推薦的質(zhì)控方法，但不應(yīng)該使用廠家建立的不精密度來建立質(zhì)控范圍。關(guān)于質(zhì)控程序的建立，可以參考CLSI C24文件。(3)實(shí)驗(yàn)記錄:實(shí)驗(yàn)應(yīng)記錄的內(nèi)容包括儀器名稱和檢測信息(分析物種類、數(shù)量、單位)、試劑和校準(zhǔn)品批號(hào)、選擇某測量濃度的理由、樣本信息(組成、不確定度等)、精密度聲明的來源(通常是廠家的藥品說明書里的表格)、實(shí)驗(yàn)所用的軟件工具以及它們的版本號(hào)、檢測數(shù)據(jù)回顧和數(shù)據(jù)處理的個(gè)人責(zé)任、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和延期的任何決定。(4)數(shù)據(jù)處理方法:當(dāng)選定了一種數(shù)據(jù)處理的方法后，應(yīng)注意一些潛在的誤差來源：如每一個(gè)計(jì)算步驟的公式轉(zhuǎn)變需要額外校對，合理進(jìn)行有效數(shù)字的取舍，注意表格的完整性和公式的正確性等。

1.2.2設(shè)備和環(huán)境要求 所有用于精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的設(shè)備均應(yīng)在使用前核查是否處于受控狀態(tài)，在設(shè)備運(yùn)行期間應(yīng)保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境始終處于受控狀態(tài)，無空氣污染，通風(fēng)足夠，如每小時(shí)至少換氣6次(尤其是有機(jī)械通風(fēng)裝置的房間內(nèi))。

1.2.3實(shí)驗(yàn)室要求 需有足夠時(shí)間開啟和運(yùn)行儀器以確保操作者理解儀器的全部步驟并能正確操作。

1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1時(shí)間、批次及重復(fù)次數(shù) 基本的5×5設(shè)計(jì)：要求至少檢測2個(gè)不同濃度樣本，至少檢測5 d(可以不連續(xù))，每天1批，每批重復(fù)測量5次。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每個(gè)樣本總共得到25個(gè)結(jié)果[6]。為獲得更可靠的精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)，可以將檢測時(shí)間增加為7 d。

1.3.2樣本 (1)樣本選擇:應(yīng)至少選擇2個(gè)樣本，最好是患者血清或混合血清，或者商業(yè)性的質(zhì)控材料，盡量與廠家建立精密度聲明時(shí)所用材料一致[8-10]。(2)濃度選擇：樣本應(yīng)有不同的檢測濃度，最好有一個(gè)代表了臨床決定值(臨界值)或參考限附近，或簡單地落在正常和異常范圍。應(yīng)避免使用極高、極低濃度樣本[11]，因?yàn)樗隽藦S家說明書的水平范圍，需要外推計(jì)算，或者得到的結(jié)果可能會(huì)超出某些重復(fù)檢測范圍。(3)樣本保存：應(yīng)注意樣本儲(chǔ)存條件，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間樣本的穩(wěn)定性，降低因樣本不穩(wěn)定帶來的精密度影響。習(xí)慣做法是能整個(gè)使用和解凍的樣本，以方便檢測。在決定樣本體積和數(shù)量的時(shí)候，要注意無效腔以及有可能要用到的額外批次的檢測。(4)樣本處理：應(yīng)嚴(yán)格按照要求進(jìn)行樣本處理，避免不同操作者帶來的差異，樣本處理過程要與廠家建立精密度聲明時(shí)所做的保持一致；不同濃度樣本可以在不同天或不同批內(nèi)檢測完畢，檢測時(shí)需先做質(zhì)控，質(zhì)控在控時(shí)結(jié)果可以接受，如失控需查明原因，拒絕所有檢測結(jié)果，缺失的結(jié)果需額外補(bǔ)齊。

2 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)流程

精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)給用戶提供了精密度性能驗(yàn)證的指引和方法。為了區(qū)分廠家的不精密度聲明和用戶的不精密度驗(yàn)證值，本文分別用σR、σWL表示廠家聲明的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度，用SR、SWL表示用戶驗(yàn)證的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度。通常，廠家有兩種精密度聲明——重復(fù)性(批內(nèi)不精密度) 和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度[10]。本部分內(nèi)容提供了從這兩種聲明中識(shí)別總變異的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。圖1為樣本的(重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi))不精密度的驗(yàn)證和分析圖。

圖1 樣本精密度(重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi))驗(yàn)證分析圖

3 數(shù)據(jù)分析

3.1測量數(shù)據(jù)判斷

3.1.1數(shù)據(jù)完整性判斷 每天都應(yīng)檢查所有結(jié)果，如果由于檢測系統(tǒng)或室內(nèi)質(zhì)控導(dǎo)致需要拒絕該批結(jié)果，應(yīng)及時(shí)查找原因補(bǔ)充數(shù)據(jù)。

3.1.2各樣本數(shù)據(jù)分析 注意：本文內(nèi)容假設(shè)用戶實(shí)驗(yàn)時(shí)使用最基本的5×5設(shè)計(jì)，也可多1～2個(gè)批次，可使用單因素ANOVA軟件進(jìn)行分析。按照5×5設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)得到的總膽紅素結(jié)果，見表1。表中總膽紅素檢測結(jié)果無缺失值，根據(jù)Grubb′s法25個(gè)結(jié)果中無離群值[6]，具體分析：計(jì)算所有結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，Grubbs′因子G(取決于N，當(dāng)數(shù)據(jù)是平衡無缺失時(shí)N=25，G一般為3.135，n0則為5)[6]。也可以根據(jù)《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋 正態(tài)樣本離群值的判斷和處理其他方法》進(jìn)行離群值判斷[12]?？偰懠t素所有結(jié)果均值為18.8和0.22 μmol/L，Grubbs′范圍的上、下限計(jì)算：Grubbs′限值=均值±G·SD=18.8±3.135×0.22=18.1或19.5 μmol/L。表1中數(shù)據(jù)均在該范圍內(nèi)，所以無離群值。

表1 總膽紅素精密度驗(yàn)證原始數(shù)據(jù)(μmol/L)

3.2不精密度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的單因素方差分析 精密度驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用單因素方差分析方法，可借助相關(guān)統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行，以表1中總膽紅素分析結(jié)果為例，其統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸出如表2所示。

表2 總膽紅素單因素方差分析的輸出結(jié)果

注：-表示該項(xiàng)無數(shù)據(jù)

重復(fù)性CVR=0.80%，實(shí)驗(yàn)室批間變異CVB=0.90%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度CVWL=1.22%。

4 用戶獲得的不精密度與廠家的聲明進(jìn)行比較

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)完成每個(gè)樣本的重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度的計(jì)算后，用戶應(yīng)檢查獲得的不精密度與廠家聲明的是否一致，可將結(jié)果直接與廠家聲明進(jìn)行比較，如一致則驗(yàn)證通過[14-15]；如不一致則需進(jìn)行相關(guān)的上限值(UVL)計(jì)算，必要時(shí)可聯(lián)系廠家。仍以表1中總膽紅素?cái)?shù)據(jù)為例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析總膽紅素的CVR=0.80%，CVB=0.90%，CVWL=1.22%，分別與廠家聲明的精密度(見表3)進(jìn)行比較。表1中總膽紅素濃度為18.8 μmol/L，與廠家聲明的第一個(gè)濃度相近，重復(fù)性為0.80，小于廠家聲明的2.7%；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度為1.22%，小于廠家聲明的4.66%，驗(yàn)證通過。

為了降低由于單獨(dú)機(jī)會(huì)性導(dǎo)致的確證廠家精密度聲明的失敗，可以計(jì)算廠家聲明的UVL。UVL表示當(dāng)廠家聲明正確時(shí)，從相同樣本量和相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的用戶精密度實(shí)驗(yàn)中獲得不精密度估計(jì)的95%上限，是不精密度確證實(shí)驗(yàn)是否接受的判斷標(biāo)準(zhǔn)。用戶寧可使用UVL也不單獨(dú)使用廠家聲明，這樣可以避免由于機(jī)會(huì)性引起的不恰當(dāng)?shù)尿?yàn)證失敗，使驗(yàn)證試驗(yàn)成功率至少提高5%。

對于某給定標(biāo)本，只有在用戶的重復(fù)性估計(jì)值小于或等于廠家的聲明(若失敗，必須小于或等于廠家聲明的相關(guān)UVL)的時(shí)候，才能說用戶觀察到某濃度樣本的重復(fù)性與廠家聲明一致。由于 UVL經(jīng)常大于相關(guān)的聲明，用戶的估計(jì)值通常至少大于廠家的聲明30%，仍然算通過。

如果用戶的估計(jì)值超出了廠家聲明，用戶應(yīng)將得到的估計(jì)值與聲明的UVL比較，以總膽紅素精密度驗(yàn)證為例?？偰懠t素廠家精密度聲明1、2、3的均值分別為20.6、80.3、160.8 μmol/L。通過下列三步計(jì)算 UVLs[6]。(1)計(jì)算自由度df，用于尚在疑問中的不精密度估計(jì)(dfR是重復(fù)性的不精密度，dfWL是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度)。(2)從EP15-A3文件中查得UVL的F因子。(3)利用UVL的F因子計(jì)算UVL和廠家的聲明。將用戶的不精密度與UVL進(jìn)行比較。對于重復(fù)性比較，計(jì)算重復(fù)性的自由度dfR。dfR=N-k，N是結(jié)果的總數(shù)目，k是檢測批次的數(shù)目。對于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度比較，首先計(jì)算聲明的比率ρ：ρ=σWL/σR=%CVWL/%CVR，ρ是用廠家的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度聲明除以廠家的重復(fù)性聲明，可以用SD表示，也可以用CV表示。然后從EP15-A3中得到大概的自由度，dfWL。見表3。

表3 總膽紅素廠家不同精密度聲明的UVLs計(jì)算

5 結(jié)果解釋

精密度驗(yàn)證所有數(shù)據(jù)分析和一致性檢驗(yàn)完成后，用戶擁有：(1)實(shí)驗(yàn)中每個(gè)測試樣本的“重復(fù)性”和“實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度的估計(jì)值”。(2)一致性檢驗(yàn)結(jié)果(通過或失敗)。

用戶還應(yīng)檢查一致性檢驗(yàn)結(jié)果是否覆蓋精密度確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的所有樣本濃度范圍。如果所有結(jié)果都在確認(rèn)范圍內(nèi)，則用戶的精密度與廠家的聲明一致(注：由于樣本數(shù)量有限，統(tǒng)計(jì)結(jié)果有可能接受了錯(cuò)誤的通過和錯(cuò)誤的失敗)。精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)完成后，可能會(huì)有以下3種情況。情況1A：所有估計(jì)值都通過，接近或低于廠家聲明或 UVLs，證明用戶實(shí)驗(yàn)室的不精密度與廠家聲明具有可比性。情況1B：所有估計(jì)值通過，但有些勉強(qiáng)通過，該情況表明用戶實(shí)驗(yàn)室所有結(jié)果，或者部分檢測范圍內(nèi)結(jié)果的不精密度可能超出廠家聲明?？傮w來講該實(shí)驗(yàn)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上還是與廠家聲明一致。情況2：大多數(shù)估計(jì)值通過，但有些沒通過。實(shí)驗(yàn)負(fù)責(zé)人應(yīng)回顧實(shí)驗(yàn)，判斷該檢驗(yàn)程序的不精密度是否與廠家的聲明完全不符，該檢驗(yàn)程序是否仍可接受使用。如可接受使用，人應(yīng)詳細(xì)闡述接受的理由，并監(jiān)控日常質(zhì)控的不精密度。情況3：好幾個(gè)估計(jì)值均未通過，實(shí)驗(yàn)總體與廠家聲明不一致。用戶可以有3個(gè)選擇：(1)完全拒絕該檢驗(yàn)程序；(2)尋找故障，比如說在廠家?guī)椭拢貜?fù)整個(gè)精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)；(3)為確定該檢驗(yàn)程序精密度性能特征，做天數(shù)和次數(shù)更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

6 注意事項(xiàng)

成功完成精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后，用戶可以將該檢驗(yàn)程序投入使用。使用過程中，室內(nèi)質(zhì)控作為實(shí)驗(yàn)室不精密度的主要反映，通過長時(shí)間監(jiān)控日常質(zhì)控樣本收集到的統(tǒng)計(jì)資料更能代表實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不精密度[8]。但如果出現(xiàn)試劑或定標(biāo)物批號(hào)的改變，儀器維修、試劑穩(wěn)定性改變、實(shí)驗(yàn)環(huán)境因素變化、新操作者或分析前因素的影響等情況時(shí)，日常質(zhì)控結(jié)果得到的不精密度值可能會(huì)超出廠家聲明，用戶應(yīng)充分考慮并排除或降低這些變異因素。

如果用戶“實(shí)驗(yàn)室內(nèi)精密度”聲明通過，但“重復(fù)性”聲明沒有通過，則反映了實(shí)驗(yàn)中“批”的差異。如廠家是通過雙份檢測得到，而用戶的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可能包含了更長的時(shí)間范圍。

本文假設(shè)廠家的精密度聲明準(zhǔn)確地代表了檢測方法目前的性能，也假設(shè)了廠家的聲明是沒有特別明顯的不確定度。表格列出了跟不確定度相關(guān)的不精密度統(tǒng)計(jì)資料，但廠家聲明的精密度實(shí)驗(yàn)可能不那么嚴(yán)謹(jǐn)，包括檢測天數(shù)也達(dá)不到經(jīng)典的CLSI文件EP05的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]；對于某給定濃度和精密度類型，當(dāng)用戶的精密度既沒有落入可允許變異范圍也超出了廠家聲明計(jì)算出來的UVL的時(shí)候，用廠家聲明會(huì)比用臨床可允許變異范圍要好得多。這種情況下，即使精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)沒有通過廠家聲明，用戶也可選擇接受檢測方法的精密度性能。