利用蝸牛消化酶獲得植物原生質(zhì)體*

楊 令 曹祥華

（1 北京師范大學(xué)蕪湖附屬學(xué)校 安徽蕪湖 241080 2 懷寧縣高河中學(xué) 安徽懷寧 246121）

植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁后被原生質(zhì)所包圍的“裸露細(xì)胞”。植物細(xì)胞被細(xì)胞壁包裹時呈不規(guī)則形態(tài)；去除細(xì)胞壁后，呈圓球形。原生質(zhì)體是開展基礎(chǔ)研究的理想材料，在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。原生質(zhì)體融合是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，不僅能克服遠(yuǎn)緣雜交有性不親和障礙，也可避免傳統(tǒng)的通過有性雜交誘導(dǎo)多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠(yuǎn)緣基因?qū)朐耘喾N中。原生質(zhì)體融合技術(shù)可望成為作物改良的有力工具之一［1］。

獲取植物原生質(zhì)體的方法有機(jī)械法和酶解法。其中酶解法是一種常用的技術(shù)，其原理是，植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，除去細(xì)胞壁［1］，而得到植物原生質(zhì)體。為了保持無細(xì)胞壁的原生質(zhì)體的活力和膜穩(wěn)定性，酶液的滲透壓必須與處理的細(xì)胞的滲透壓相近。

1 創(chuàng)新背景

人教版高中生物學(xué)選修3 教材中提及通過酶解法獲取植物原生質(zhì)體。高中階段涉及有關(guān)酶的實驗，往往采用的都是活性材料，筆者嘗試從活體蝸牛中提取蝸牛酶制備植物原生質(zhì)體，有助于學(xué)生直觀地觀察和研究原生質(zhì)體。

蝸牛是一種植食性動物。蝸牛酶是從蝸牛消化道里提取出來的一種混合酶系，包含纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、蛋白酶等20 多種混合酶。為了獲取蝸牛的消化酶，可對蝸牛進(jìn)行活體解剖，摘取嗉囊和消化道，收集消化液。然后對植物細(xì)胞進(jìn)行處理，降解其細(xì)胞壁獲得原生質(zhì)體。

綜上所述，本研究主要包括2 個實驗，即蝸牛的活體解剖實驗和原生質(zhì)體的制備與觀察。

2 材料與方法

2.1 實驗材料 菠菜或其他蔬菜的幼葉、白玉蝸牛消化道和嗉囊。

2.2 實驗試劑 配制13%細(xì)胞-原生質(zhì)體清洗液（CPW 洗液）：2×10-4mol／L KH2PO4、1×10-3mol／L KNO3、1×10-2mol／L CaCl2、2.05×10-3mol／L MgSO4、1×10-6mol／L KI、1.5×10-8mol／L CuSO4、13% W／V甘露醇pH=6.0。

其中，13%甘露醇使植物細(xì)胞質(zhì)壁分離，有助于酶解細(xì)胞壁；鈣離子能穩(wěn)定細(xì)胞膜的活性。CPW洗液沖洗蝸牛消化道，獲取溶解有消化酶的混合液［2］。混合液處理葉肉細(xì)胞后，可洗脫原生質(zhì)體，維持滲透壓保持原生質(zhì)體的正常形態(tài)。

2.3 實驗器材 顯微鏡、載玻片、蓋玻片、注射器、鑷子等。

2.4 實驗步驟

2.4.1 蝸牛的活體解剖

1）實驗材料的預(yù)處理。從花鳥寵物市場購買白玉蝸牛若干，饑餓2～3 d，用清水沖洗干凈；將蝸牛置于燒杯中，注滿清水，加入少許乙醚；麻醉處理后的蝸牛軟體部分伸展，便于解剖和觀察。

2）去殼。用手術(shù)剪從殼口開始沿著縫合線，順著蝸牛殼螺旋的方向剪開殼，直至殼頂；在剪的過程中，蝸牛殼會慢慢脫落下來，用鑷子邊剪邊將碎殼除凈。蝸牛的軟體部分附著在殼軸上，小心將其從殼軸上取下。剪時注意不要破壞蝸牛的軟體結(jié)構(gòu)。去殼后的蝸牛如圖1所示。

圖1 蝸牛去殼

3）解剖。將去殼的蝸牛軟體部分置于蠟盤中，分別在蝸牛頭部兩側(cè)和足的后部，插入1 根大頭針固定于蠟盤中。

將手術(shù)剪插入呼吸孔中，順著領(lǐng)與頭部體壁連接處，剪開外套膜。然后調(diào)轉(zhuǎn)剪刀方向，順著外套膜與身體的連接處，稍偏直腸的下緣剪開外套膜，將直腸保留在剪開的外套膜上。

蝸牛的口位于身體前端的頭部腹面, 口后肌肉質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)稱為口球, 口球內(nèi)有攝食器官顎片和齒舌；口球后與食道相連,食道處與膨大的嗉囊相連； 嗉囊背部有2 個淡黃色分支的管狀腺體稱為唾液腺，唾液腺由唾液腺管直接通入食道；嗉囊后面稱為后食道,直通胃,胃呈袋狀；小腸比較長,在內(nèi)臟囊中迂回盤旋,小腸后面與直腸相接；肛門開口位于身體體右側(cè)近外套腔出口處。順其消化道剪開體壁剝離消化道（圖2），摘取嗉囊。放在pH=5.0 的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液中。

2.4.2 提取蝸牛消化酶 用注射器吸取13% CPW 洗液5 mL，從消化道的一端插入，反復(fù)注射幾次。使蝸牛消化道里的消化酶充分洗脫后，置于離心管中待用［3］。

2.4.3 用蝸牛消化酶提取原生質(zhì)體 取幼嫩的菠菜葉，小心用鑷子撕取下表皮，暴露葉肉組織。剪取幾小塊葉肉組織置于蝸牛消化酶離心管中，酶解1～2 h，過程中可稍微晃動幾次。

圖2 蝸牛消化道分離

2.4.4 制作臨時裝片 取2 個潔凈的載玻片，用膠頭滴管從離心管中吸取酶解后的組織樣液，滴1 滴于載玻片的中央，輕輕蓋上蓋玻片。對照組為菠菜葉肉組織切片。

2.4.5 鏡檢 先在低倍鏡下找到原生質(zhì)體（圖3），再換成高倍鏡仔細(xì)觀察，做好記錄。畫出在顯微鏡下看到的原生質(zhì)體的圖像。

圖3 低倍鏡原生質(zhì)體

3 結(jié)果

完整的原生質(zhì)體形態(tài)上是圓球形，顏色鮮艷，富含細(xì)胞質(zhì)。

實驗中所用材料主要是葉肉細(xì)胞，因此大部分原生質(zhì)體均富含葉綠體； 個別原生質(zhì)體可能是表皮細(xì)胞或保衛(wèi)細(xì)胞形成，是無色的觀察不到葉綠體。原生質(zhì)體的大小差異是源于植物體細(xì)胞的大小不同。一般生活著的原生質(zhì)體均是圓球狀的，性狀扁或者不規(guī)則的，往往是死亡的。

4 討論

該方法具有條件溫和、原生質(zhì)體完整性好、活力高、產(chǎn)率高等優(yōu)點，但是使用蝸牛酶也存在一定的副作用。由于蝸牛酶是由多種酶組合成的復(fù)雜酶系，其中所含的蛋白酶等可能會對細(xì)胞膜產(chǎn)生不可逆的傷害，因此在實際科學(xué)研究中需要酌情考慮使用該方法。在高中階段，只需要體驗制備原生質(zhì)體的過程和直觀觀察原生質(zhì)體即可，無需考慮其他酶對實驗結(jié)果的影響。但是在實驗過程中一定要把握酶解的時間和溫度；時間過短，細(xì)胞壁分解不徹底；酶解時間過長，則可能會在其他酶作用下，原生質(zhì)膜破裂而死亡；酶解的溫度過高或過低，細(xì)胞壁分離不徹底，將導(dǎo)致不能得到完整的原生質(zhì)體。