激光對小麥增強(qiáng)UV-B輻射POD影響的研究

王 鵬（山西省太谷中學(xué)校 山西太谷 030800）

自從1980年以來，全球許多區(qū)域上空臭氧（O3）總量顯著下降，特別在20 世紀(jì)90年代，相比前幾十年，臭氧量更是顯著下降，且目前呈繼續(xù)降低趨勢。臭氧層耗損導(dǎo)致的最直接的后果是近地面短波輻射，特別是UV-B（波長在290～320 nm之間的紫外線）輻射的增加，科學(xué)家認(rèn)為今后20年內(nèi)臭氧層是處于最脆弱狀態(tài)的時(shí)期，一些影響將在21 世紀(jì)的大部分時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)［1］。

增強(qiáng)的UV-B 直接影響生物的生活與生存，導(dǎo)致許多動、植物在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、遺傳特性和生長周期等方面發(fā)生改變［2］，進(jìn)而直接或間接地對人類的生存構(gòu)成威脅。因此，揭示UV-B 對生物，尤其是對農(nóng)作物的損傷及修復(fù)機(jī)理尤為重要。

小麥作為一種重要的糧食作物，受UV-B 輻射后在形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、生理生化和DNA 水平等各方面都發(fā)生了明顯的變化。形態(tài)結(jié)構(gòu)方面：植株矮化，葉面積減小，氣孔數(shù)減少，葉子卷曲，節(jié)間縮短，腋芽增多，葉上表皮臘質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，表皮增厚、色素堆積、葉綠素重新分布，并出現(xiàn)明顯的“翹根”現(xiàn)象；細(xì)胞水平：細(xì)胞有絲分裂率降低，產(chǎn)生落后染色體、染色體橋、游離染色體、核變形等畸變，出現(xiàn)了“分束分裂”的現(xiàn)象；生理生化水平：丙二醛（MDA）、還原型抗壞血酸（AsA）的濃度增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性無明顯變化，過氧化物酶（POD）的活性增強(qiáng)［3］；DNA 分子水平：主要是使同一條鏈上相鄰的2 個(gè)嘧啶堿基形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體（CPDs）和6-4 光產(chǎn)物（6-4PPS）。細(xì)胞可通過光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS 修復(fù)等途徑進(jìn)行修復(fù)。

激光已被廣泛用做研究手段，其生物效應(yīng)可分為光效應(yīng)、電磁效應(yīng)、熱效應(yīng)和壓力效應(yīng)。已有研究表明，適當(dāng)激光照射可提高種子萌發(fā)力［4］，提高酶活性，增強(qiáng)抗逆性［5］，同時(shí)也可促進(jìn)DNA 損傷修復(fù)的進(jìn)行。這些研究對于增強(qiáng)植物抗輻射能力，提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)采用He-Ne 激光（可見光激光［6］）處理增強(qiáng)UV-B輻射的小麥，以其在過氧化酶POD 方面的功效反映He-Ne 激光在小麥UV-B 輻射損傷修復(fù)中的影響和作用機(jī)制。

目前研究人員正從分子水平進(jìn)行研究，以便更深層次探討UV-B 輻射對植物的傷害。同工酶分析是從分子水平研究植物抗逆性的一種有效手段。同工酶是具有恒定性質(zhì)的酶的各種類型，是基因表達(dá)的產(chǎn)物； 過氧化物酶都可清除生物體內(nèi)的H2O2。其不同之處是前者催化H2O2分解為H2O 與O2；而后者催化H2O2氧化其他底物（以SH2表示）后才產(chǎn)生H2O［7］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用冬小麥臨遠(yuǎn)93-4736（Triticum aestivum，cv.），由山西省農(nóng)科院小麥研究所提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 恒溫光照培養(yǎng)箱、光照培養(yǎng)箱、大功率激光生物輻照儀、酸度計(jì)、電子天平、逆滲透純水機(jī)、超速冷凍離心機(jī)、恒溫磁力攪拌器、超凈水儀及玻璃儀器烘干器。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 氯化汞、碘化鉀、Tris-甘氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、四唑藍(lán)鹽、三羥甲基氨基甲烷、氯化鎂、Tris-鹽酸、3%雙氧水、乙二胺四乙酸、過硫酸氨、聯(lián)苯胺、醋酸、溴酚藍(lán)、蔗糖、四甲基乙二胺、蒸餾水及雙蒸水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 選取最佳激光照射時(shí)間 用He-Ne 激光（8 mW／mm2）輻照方法，探究增強(qiáng)UV-B［10.08 kJ／（m2·d）］輻射下小麥在生化方面自我修復(fù)的影響。為確定輻照的最佳時(shí)間，采取了不同照射時(shí)間（表1）；第4 組在各組中是修復(fù)最好的，最終確定輻照時(shí)間4 min 是最佳時(shí)間。

表1 各處理組設(shè)置及處理程序

1.4.2 種子萌發(fā) 設(shè)置對照組（CK）、UV-B 處理組（B）、UV-B 和激光復(fù)合處理組（BL）共3 組，處理方法見表2。選取籽粒飽滿，大小均一的小麥種子，經(jīng)0.1% HgCl2表面消毒后，培養(yǎng)于有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)。25℃恒溫培養(yǎng)，種子露白時(shí)待處理。

表2 處理組設(shè)置及處理程序

1.4.3 UV-B 輻射處理 將UV－B 燈垂直懸于培養(yǎng)皿上方，通過調(diào)整UV-B 燈與植物培養(yǎng)皿之間的距離控制UV-B 的輻射強(qiáng)度。采用10.8 kJ／（m·d）的輻射劑量處理萌發(fā)小麥，每天處理8 h，共處理6 d。

1.4.4 He-Ne 激光輻照 He-Ne 激光器波長為632.8 nm，選用劑量為8 mW／mm2，240 s，25℃。激光輻照處理安排在夜間進(jìn)行，以排除雜光影響，激光處理后立即轉(zhuǎn)入暗處25℃培養(yǎng)。

1.4.5 形態(tài)特征指標(biāo)的測定 種子處理3 d 后，每天統(tǒng)計(jì)各處理組的發(fā)芽數(shù)，測量株高、根長，分別求其平均值；以百分比表示其發(fā)芽率，同時(shí)對株高、根長等形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行記錄和統(tǒng)計(jì)。

1.4.6 POD 酶液的提取 每組取小麥葉片0.5 g，切碎，放人研缽中，加5 mL 0.2 mol／L（pH=7.8）磷酸緩沖液研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，以3 000 g 離心10 min ，上清液即為POD的粗提液。低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.7 凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠濃度采用分離膠7%和濃縮膠4%（表3），電極緩沖液Tris-甘氨酸pH=8.7。垂直平板凝膠（厚1.0 mm，共10 齒），以樣品∶蔗糖∶溴酚蘭＝10∶10∶1 的比例配置樣品。每齒點(diǎn)樣15 μL，電泳時(shí)濃縮膠10 mA，電泳時(shí)間30 min，分離膠20 mA，電泳時(shí)間8 h。

表3 聚丙烯酰胺凝膠配制方法（單位：mL）

1.4.8 POD 染色 取醋酸聯(lián)苯胺溶液（2 g 聯(lián)苯胺溶于18 mL 醋酸中，加72 mL 水）5 mL，3% H2O22 mL，加蒸餾水93 mL。將取出的膠浸入染色液中5～10 min，取出用水漂洗，停止染色［8］。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 形態(tài)特征的變化 經(jīng)UV-B 處理的小麥明顯表現(xiàn)出以下特征：生長發(fā)育遲緩，株高較低；發(fā)芽率明顯降低，生長勢下降；葉片較短、卷曲，萌發(fā)初期卷為蝸牛狀，逐漸由葉尖開始泛黃；根普遍很短，但根數(shù)較多，根色泛黃；在增強(qiáng)UV-B 輻照下，小麥幼苗根尖出現(xiàn)“翹根”現(xiàn)象，幼根翹起，脫離基質(zhì)，無法吸水以至干枯。

與UV-B 處理組相比，經(jīng)激光處理后，有明顯的修復(fù)效應(yīng)。小麥生長發(fā)育較快，植株變高；發(fā)芽率提高，生長勢上升；葉片長勢較好，卷曲，泛黃較少；根長有所增加。并且在增強(qiáng)UV-B 輻照下出現(xiàn)的“翹根”現(xiàn)象，經(jīng)激光處理后，其現(xiàn)象減少，翹根不太明顯。但整體上和CK 組有一定差距。

2.2 凝膠拍攝與分析 電泳后，膠板在Gel Media System 中分析：圖象采集用佳能Power Shot G2 數(shù)碼相機(jī)，再用Gel-Pro Analyzer 軟件進(jìn)行分析。

2.2.1 POD 電泳圖譜 由電泳圖譜（圖1）可知，經(jīng)UV-B 輻射處理后，酶帶變淺，變少。結(jié)果表明，經(jīng)紫外線輻射后，POD 的含量減少，酶的活性降低。而BL 組則明顯優(yōu)于B 組，卻差于CK 組。

圖1 POD 電泳圖譜

2.2.2 POD 曲線分析 將各處理組凝膠電泳圖譜中最清晰的2 條條帶進(jìn)行曲線分析，CK 組、BL組及B 組各Rf 曲線見圖2。比較3 組曲線，峰面積CK 組大于B 組，而BL 組與CK 組差別不大。BL 組也明顯大于B 組。

圖2 CK 組、B 組和BL 組Rf 曲線圖

2.2.3 OD 值的比較 各組最大OD 值見表4。1和2 是CK 組，3 和4 是BL 組，5 和6 是B 組。在同一峰值中，同組的相差不大，而CK 組大于BL組都明顯大于B 組。而OD 值反映的是酶的濃度與含量，可看出BL 組明顯優(yōu)于B 組。

表4 Rf 曲線最大OD 值比較

3 討論

3.1 翹根現(xiàn)象 在增強(qiáng)UV-B 輻射下，小麥幼苗根系彎翹，向著UV-B 光源方向彎曲，其機(jī)理有待進(jìn)一步探討。

3.2 POD 的變化 POD 是植物體內(nèi)的一種典型的過氧化物酶，增強(qiáng)UV-B 輻射能改變POD 的活性。UV-B 輻射一方面加快了活性氧的產(chǎn)生，另一方面破壞了POD 等的保護(hù)酶系統(tǒng)，導(dǎo)致活性氧等過氧化物的積累，加速膜脂過氧化，造成膜系統(tǒng)破壞及代謝異常。酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，由于增強(qiáng)UV-B 從分子水平破壞了生物大分子，使DNA 分子受損，酶的表達(dá)也受損。紫外線輻射下，植物體內(nèi)清除活性氧等過氧化物的防衛(wèi)系統(tǒng)受到破壞，POD 與活性過氧化物之間的平衡打破，致使活性過氧化物在體內(nèi)積累，造成植物結(jié)構(gòu)功能受損，蛋白質(zhì)表達(dá)減少，包括POD 含量也減少。

植物具有適應(yīng)性，適當(dāng)?shù)腢V-B 輻射能依靠自身的修復(fù)機(jī)制進(jìn)行。有研究表明，激光照射可促進(jìn)小麥對UV-B 的損傷修復(fù)［12］。適當(dāng)激光照射可能主要通過磁場效應(yīng)首先活化某些基因，使這些基因開始轉(zhuǎn)錄，合成mRNA；其次，活化核糖體上蛋白質(zhì)合成作用因子，從而使新出現(xiàn)的mRNA 翻譯，合成新蛋白質(zhì)。新蛋白質(zhì)的出現(xiàn)可反映處于上游的某些基因已經(jīng)表達(dá)。

3.3 He-Ne 激光的作用機(jī)理 激光對生物體的刺激效應(yīng)已在多種植物中得到了廣泛研究。已有研究表明，激光對生物體的作用主要表現(xiàn)為光效應(yīng)、電磁效應(yīng)、熱效應(yīng)和壓力效應(yīng)［9］。但低功率的激光特別是可見光范圍的激光，其產(chǎn)生的熱和壓力很少。因此，激光對生物體的影響就主要表現(xiàn)為光效應(yīng)和電磁效應(yīng)。然而，產(chǎn)生光效應(yīng)的光源必須是線性偏振的，用非相干的熱光源（λ=630 nm）輻照時(shí)無效［9］。起作用的就有可能是激光的電磁效應(yīng)，其中主要是磁場效應(yīng)。磁場可通過許多方式影響生物分子（包括蛋白質(zhì)和酶）的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致生物活性的變化［10］。低功率的激光能促進(jìn)生物體內(nèi)酶的活性［11］。

當(dāng)小麥?zhǔn)躑V-B 脅迫輻射后，可引起DNA 的一條鏈上2 個(gè)相鄰胸腺嘧啶殘基的穩(wěn)定聯(lián)結(jié)，可導(dǎo)致基因失活；UV-B 也有很強(qiáng)的致突性造成堿基的取代、缺失或插入，這些損傷的形成直接影響DNA 的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而在細(xì)胞或者是植株水平上表現(xiàn)出損傷效應(yīng)。低功率的激光不僅能提高生物體內(nèi)酶的活性，而且能增強(qiáng)生物體內(nèi)的光修復(fù)、切除修復(fù)等。