不同治則對非小細胞肺癌患者調(diào)節(jié)性T 細胞、髓源抑制性細胞的影響＊

許榮忠，方志紅，徐 靜，李 雁

（上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院 上海 200071）

原發(fā)性肺癌簡稱肺癌，其中約70%在臨床確診時已屬肺癌晚期，失去了最佳手術(shù)機會，5 年生存率僅14%左右[1]。放射治療和化療在控制病灶、延長生存方面有一定優(yōu)勢，但因其毒副作用常常使患者無法耐受，從而影響總體療效。而中醫(yī)中藥具有明確地減輕化療不良反應、提高總體療效、增強自身抵御病邪能力、促進機體康復的綜合作用[2]。因此，中醫(yī)藥在肺癌的綜合治療體系中具有不可替代的作用。目前從“扶正”與“祛邪”不同治則角度對中醫(yī)藥治療肺癌的有效性進行研究，有助于提高中醫(yī)藥精準治療的水平，但尚未見系統(tǒng)報道，因此本課題研究主要目的，是觀察扶正與祛邪不同治則對非小細胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCLC）患者免疫功能的影響，為中醫(yī)藥治療肺癌提供思路。

1 研究方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫(yī)診斷標準

經(jīng)影像學檢查，并經(jīng)細胞學或病理學檢查證實為原發(fā)性非小細胞肺癌者。

1.1.2 中醫(yī)診斷標準

參照中華人民共和國衛(wèi)生部《中藥新藥治療原發(fā)性支氣管肺癌的臨床研究指導原則》（2002年版）中相關(guān)標準。

1.2 納入標準

①經(jīng)病理或細胞學檢查確診為非小細胞肺癌患者；②年齡在18 歲至80 歲之間（含18、80 歲）；③預計生存期3 個月以上；④卡氏評分≥60 分；⑤一個月內(nèi)沒有進行過放化療及其他中藥治療；⑥自愿參加本研究，能隨訪。

1.3 排除標準

凡有下列情況之一者，不作為入選病例：

①有心、肝、腎等嚴重疾患者，及其功能嚴重障礙者，精神病患者；②近3個月內(nèi)曾接受過免疫治療或使用過糖皮質(zhì)激素者；③合并其他免疫因素性疾病者；④行化療或放化療結(jié)束不足1個月者及正在進行其他抗癌治療者；⑤妊娠期或哺乳期婦女；⑥不能配合本次研究者。

1.4 剔除標準

①失訪者；②凡未按規(guī)定用藥，無法判定療效或資料不全者；③治療期間因毒性反應嚴重停止用藥者；④治療期間因疾病進展需更換治療方案者。

1.5 分組及用藥方法

A 組：益氣養(yǎng)陰方試驗組：華蟾素、消癌平+益氣養(yǎng)陰方；B組：清熱解毒方試驗組：華蟾素、消癌平+清熱解毒方；C組：益氣養(yǎng)陰解毒方試驗組：華蟾素、消癌平+益氣養(yǎng)陰解毒方。

注射用消癌平用法：40 mL 靜脈滴注，每天一次，連續(xù)用2 周，停用2 周作為一療程。注射用華蟾素用法：20 mL 靜脈滴注，每天一次，連續(xù)用2 周，停用2 周作為一療程。中藥湯劑口服，日一劑，水煎服300 mL，分兩至三次溫服，服用4周為一療程。

1.6 研究藥物的名稱和規(guī)格

1.6.1 基礎治療方案用藥：為三組患者均使用的基礎治療中藥針劑

（1）華蟾素注射液

成份：華蟾素；劑量規(guī)格：5 mL；生產(chǎn)單位：安徽金蟾生化股份有限公司；保存條件：避光、密閉25℃以下保存。

（2）消癌平注射液

成份：主要成分為通關(guān)藤；劑量規(guī)格：2 mL；生產(chǎn)單位：南京圣和藥業(yè)有限公司；保存條件：避光、密閉，在干燥處保存。

1.6.2 三組不同治療用藥

（1）益氣養(yǎng)陰方

藥物組成：黃芪30 g，黨參12 g，炒白術(shù)15 g，白茯苓15 g，陳皮12 g，北沙參30 g，麥冬15 g，天冬l5 g，枸杞子18 g，女貞子15 g，炒谷芽30 g，炒麥芽30 g，焦六曲15 g，焦山楂15 g。

（2）清熱解毒方

藥物組成：石上柏30 g，石見穿30 g，半枝蓮30 g，魚腥草30 g，谷芽30 g，炒谷芽30 g，炒麥芽30 g，焦六曲15 g，焦山楂15 g。

（3）益氣養(yǎng)陰解毒方

藥物組成：黃芪30 g，黨參12 g，炒白術(shù)15 g，白茯苓15 g，陳皮12 g，北沙參30 g，麥冬15 g，天冬l5 g，枸杞子18 g，女貞子15 g，石上柏30 g，石見穿30 g，半枝蓮30 g，魚腥草30 g，炒谷芽30 g，炒麥芽30 g，焦六曲15 g，焦山楂15 g。

以上藥物均由上海市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供。本試驗藥物具備藥檢部門的檢驗報告。

1.7 實驗方法

（1）分別于患者行首次中醫(yī)藥治療前、3個療程后復診時清晨空腹抽取外周血2 mL，至于EDTA抗凝管，將采集后血液標本放置于4℃冰箱中保存。

（2）在流式管中加入2 mL 淋巴細胞分離液，再抽取2 mL的血液標本沿管壁緩慢加入流式管中。

（3）按3000 轉(zhuǎn)·min-1 的速度離心30 min，抽取中間絮狀物淋巴細胞，加入3 mL 的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）。

（4）按1000 轉(zhuǎn)·min-1的速度離心5 min，去上清液后每管加入3 mL 的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）充分混勻后分裝到150 uL的小EP管中，1000 rpm離心5 min，去上清液。

（5）在1.5 ml EP 管中加入以下流式抗體各5 uL：PerCP anti-human CD4、PE anti-human CD25、PerCP anti-hunman HLA-DR、PE anti-hunman CD11b、FITC anti-hunman CD33、PE anti-hunman CD127、PerCP/CY5.5 anti-hunman CD4、FITC anti-hunman CD25。均設同型對照?；靹颍覝乇芄夥跤?0 min。

（6）加入1 mL PBS，1000 rpm離心5 min，去上清液。

（7）加入PBS 液1 mL，混勻，制成單細胞懸液。備機檢測。

（8）上機分析，采用BD CytExpert軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 統(tǒng)計方法

本課題數(shù)據(jù)錄入采用EpiData軟件，統(tǒng)計分析采用SPSS22.0軟件。符合正態(tài)分布、方差齊的計量資料，治療前后比較采用t 檢驗，組間比較方差不齊采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗；組間兩兩比較采用秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢驗，等級資料采用Mann-Whitney U 檢驗。當P ≤0.05 時，認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

本研究病例來源為上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科2014年11月29日—2017年12月1日收治的非小細胞肺癌患者。所有患者均簽署知情同意書，研究方案也通過醫(yī)院倫理委員會審批。依據(jù)納入、排除標準，按隨機數(shù)字表將入組病人等概率分為A、B、C三組，共納入研究病例數(shù)166例，脫落32例，實際入組病例數(shù)134 例；同時選取54 例正常人志愿者，分別檢測Treg、MDSC 作為正常對照。非小細胞肺癌患者參照2002 年修改的國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)和美國腫瘤聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）聯(lián)合制定的肺癌TNM（T:Tumor，腫瘤；N：Node，淋巴結(jié)；M：Metastasis，轉(zhuǎn)移）分期法進行分期：Ⅰ期99例，Ⅱ期8例，Ⅲ期7例，Ⅳ期20例。

A組：益氣養(yǎng)陰組共39例（男16例，女23例）。年齡44-78歲間。Ⅰ期30例，Ⅱ期2例，Ⅲ期4例，Ⅳ期3例，腺癌33例、鱗癌3例、其它3例。

B 組：清熱解毒組共46 例（男12 例，女34 例）。年齡34-83歲間。Ⅰ期35例，Ⅱ期2例，Ⅲ期1例，Ⅳ期8例，腺癌38例、鱗癌3例、其它5例。

C組：益氣養(yǎng)陰清熱解毒組共49例（男24例，女25例）。年齡30-84 歲間。Ⅰ期34 例，Ⅱ期4 例，Ⅲ期2例，Ⅳ期9例，腺癌40例、鱗癌4例、其它5例。

經(jīng)χ2檢驗，益氣養(yǎng)陰組、清熱解毒組和益氣養(yǎng)陰解毒組在年齡、性別、病理分期構(gòu)成均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。因此，三組患者在年齡、性別、病理分期、病理類型、手術(shù)及放化療方面均具有可比性（表1）。

表1 三組性別、年齡、病理分期均衡性比較

2.2 三組治療前Treg、MDSC的比較

經(jīng)Kruskal-Wallis 秩和檢驗分析，治療前A 組、B組與C 組Treg、MDSC 水平均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），因此三組的外周血Treg、MDSC表達具有可比性（表2）。

表2 三組治療前Treg、MDSC比較

2.3 非小細胞肺癌患者治療前與健康人Treg、MDSC的比較

非小細胞肺癌患者治療前外周血Treg水平明顯高于健康人群組，有統(tǒng)計學差異（Z=-7.326，P ＜0.001），肺癌患者外周血MDSC 水平明顯高于健康人群組，具有統(tǒng)計學差異（Z=-9.753，P ＜0.001）（表3）。

表3 非小細胞肺癌患者治療前與健康人Treg、MDSC細胞的比較

2.4 非小細胞肺癌患者治療前后Treg、MDSC的比較

經(jīng)過中醫(yī)藥治療的非小細胞肺癌患者較治療前Treg、MDSC均顯著下降，有統(tǒng)計學差異（P值均＜0.05）（表4）。

2.5 三組治療前后Treg表達的比較

組內(nèi)經(jīng)非參數(shù)檢驗分析顯示，B 組和C 組可明顯降低Treg 的水平，具有顯著性差異（P＜0.05），A 組對Treg 無明顯的調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）。經(jīng)秩和檢驗分析可見，三組治療后Treg 組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），通過組間兩兩比較，B 組分別與A 組、C 組兩組在Treg均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而A組和C組在Treg 的比較則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果表明B組和A、C組比較，對降低Treg水平更有優(yōu)勢（表5）。

表4 非小細胞肺癌患者治療前后Treg、MDSC的比較

表5 三組治療前后Treg比較

2.6 三組治療前后MDSC表達的比較

組內(nèi)經(jīng)非參數(shù)檢驗分析顯示，B 組和C 組可明顯降低MDSC的水平，具有顯著性差異（P＜0.05），A組對MDSC 無明顯的調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）。經(jīng)秩和檢驗分析可見,三組治療后MDSC 組間比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）,通過組間兩兩比較，B組分別與A組、C組兩組在MDSC的比較均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而A 組和C 組在MDSC 的比較則無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。結(jié)果表明B 組和A、C 組比較，對降低MDSC 水平更有優(yōu)勢（表6）。

表6 三組治療前后MDSC比較

3 討論

3.1 正氣盛衰是肺癌發(fā)生發(fā)展的基礎，扶正祛邪是治療肺癌的總則

中醫(yī)認為疾病的產(chǎn)生與進展取決于機體邪正的盛衰。腫瘤發(fā)病主要由于氣滯血瘀、痰濕凝聚、毒邪內(nèi)結(jié)、正氣虧損，腫瘤患者為局部屬實整體為虛，正虛為本，邪實為標?！秲?nèi)經(jīng)》云：“邪之所湊，其氣必虛”，《醫(yī)宗必讀·積聚》“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”。正是由于機體的正氣先虛，內(nèi)外邪毒趁機而入，引起臟腑氣血陰陽失調(diào)，邪毒蓄積為瘤[3]。因此扶正祛邪是中醫(yī)藥治療腫瘤的主要治療大法，扶正祛邪方藥中一般具有能夠提高機體免疫功能的有效成分，從而增強人體自身免疫機能防治惡性腫瘤。

國醫(yī)大師劉嘉湘教授[4]提出“扶正治癌”治療大法，認為肺癌病機特點是局部屬實，全身屬虛，而扶正祛邪是治療腫瘤的治療大法。但同時也強調(diào)“扶正”與“祛邪”的辨證施治關(guān)系。臨床中抗腫瘤中藥、手術(shù)、放化療、靶向治療都是祛邪的方法，合理利用可達到抗癌祛邪之功效?！靶办顒t正安”，劉嘉湘認為“祛邪”治法亦能達到扶正的效果，祛邪的最終目的亦是保護機體正氣。并提出純補不攻，有“適足資寇”之害；純攻不補，則有消耗正氣之虞，反可致正不束邪，邪毒流散全身而不治。田建輝[4,5]提出“正虛伏毒”是肺癌發(fā)生與轉(zhuǎn)移的核心病機，適度的抗癌祛邪是長期取效的重要條件。

3.2 調(diào)控腫瘤免疫是扶正祛邪治則防治肺癌的途徑

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)免疫功能紊亂是多數(shù)腫瘤患者的共性問題。免疫逃逸為惡性腫瘤基本特征之一，其對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移起到至關(guān)重要的作用。而中醫(yī)藥在抗腫瘤的主要機制和調(diào)控免疫密切相關(guān)。研究顯示，常用扶正中藥如黃芪，人參，枸杞，刺五加等，可提高癌癥患者的造血功能，促進淋巴細胞的轉(zhuǎn)化[7-9]。而祛邪方藥則可以增加細胞吞噬機能，控制癌細胞的增長，如蛇舌草、石見穿、半枝蓮、金銀花等方藥[10,11]。

3.3 調(diào)節(jié)性T細胞和髓源抑制細胞是主要抑制性免疫細胞

腫瘤患者體內(nèi)存在一群髓系來源的細胞（MDSCs）[12]，可分為多個不同亞群，主要由粒細胞樣MDSC（CD11b+LY6G+LY6Clow）和單核細胞樣MDSC（CD11b+LY6G-LY6Chi）[7]組成。在多種病理狀態(tài)下，如腫瘤、感染、炎癥等發(fā)生時，MDSCs 會大量擴增和活化，從而對機體的免疫系統(tǒng)起到抑制作用，導致腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[13,14]。相關(guān)研究證實其能夠通過分泌免疫抑制細胞因子抑制T 細胞增殖；此外，MDSCs還可以通過上調(diào)共刺激分子誘導CD25-效應性T 細胞向CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞分化從而促進Tregs 擴增，或抑制自然殺傷細胞(Natural Killer Cell，NK)和樹突狀細胞起到抑制免疫應答的作用[15]。

調(diào)節(jié)性T細胞是通過影響其他細胞亞群的免疫活性，從而產(chǎn)生抑制性免疫反應的一群T 細胞。對調(diào)控機體免疫平衡具有重要作用，同時其也被認為是腫瘤免疫逃逸的一個重要因素。相關(guān)研究表明Treg介導的免疫抑制是導致腫瘤逃避機體免疫反應的一個主要因素，從而成為抗腫瘤治療的一個主要障礙。

3.4 中醫(yī)藥治療肺癌不同治則治法的確立

李雁教授認為肺癌是一本虛標實的病癥，其基本病機可以歸納為：虛為氣血陰陽虧虛，實為痰凝、血瘀、氣滯、毒聚，針對其病因病機，李雁教授主張以扶正為主，同時辨證施治針對肺癌發(fā)生發(fā)展的不同階段兼顧祛?！靶爸鶞?，其氣必虛”，“諸氣者，皆屬于肺”，正虛為肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，在肺癌發(fā)展過程中又以氣虛、陰虛為主，因此治療上扶正當以益氣養(yǎng)陰為主。外邪入侵蘊郁于肺，肺失宣降，津液不能正常輸布，煉液為痰，痰凝與邪毒互結(jié)阻遏經(jīng)絡氣血，則形成腫瘤。熱毒亦是肺癌中重要的病理產(chǎn)物，故治療上多以清熱解毒、軟堅散結(jié)為主。而臨床上往往將益氣養(yǎng)陰與清熱解毒相結(jié)合，以達到扶正以祛邪，祛邪不傷正的功效。益氣養(yǎng)陰方，組方中麥冬、天冬共為君藥益氣養(yǎng)陰、清養(yǎng)肺胃；配合生黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、北沙參等益氣健脾藥為臣藥以健脾胃，“脾胃一虛，肺氣先絕”，方中包含四君子湯益氣健脾平補脾胃起到培土生金之功效，佐以炒谷麥芽、焦六曲、焦山楂以消食導滯。久病傷陰，臨床上以肺氣陰虛型肺癌多見，益氣養(yǎng)陰方是李雁教授臨床經(jīng)驗方以養(yǎng)陰潤肺為主，為治療肺癌主方之一。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰中藥在腫瘤發(fā)展過程中具有調(diào)控粘附相關(guān)分子的表達及血管生成等來控制腫瘤的進展。

肺為嬌臟，喜潤惡燥，熱毒易侵，肺失宣降，輕陽不升，痰濁上擾，痰毒凝結(jié)成腫塊，故清熱解毒方中以石上柏、石見穿、半枝蓮、魚腥草等清熱解毒藥物為君藥以解毒散結(jié)、化痰通絡，佐以炒谷麥芽、焦六曲、焦山楂以健胃消食。熱毒是內(nèi)科癌病的致病因素之一，諸多研究發(fā)現(xiàn)清熱解毒中藥具有不同程度的抗癌活性功效，其通過多種途徑起到抗腫瘤的作用，主要有抑制腫瘤血管生成、抑制癌細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、增強調(diào)節(jié)機體細胞免疫能力等。

中醫(yī)治療腫瘤從整體出發(fā)，注重辨證論治，在肺癌發(fā)展的不同階段，常常表現(xiàn)出本虛標實等不同癥狀，益氣養(yǎng)陰解毒方以天冬、麥冬益氣養(yǎng)陰，配合石上柏、石見穿、半枝蓮、魚腥草等清熱解毒藥物共為君藥以達到“養(yǎng)正則積自除”、“祛邪而不傷正”的目的。以黃芪，黨參，炒白術(shù)，白茯苓，陳皮，北沙參等為臣藥健脾益氣以固后天之本，佐以炒谷麥芽、焦六曲、焦山楂以消食導滯。遣方用藥得當，故在臨床上取得較滿意的效果。

3.5 不同治則對Treg和MDSC的調(diào)控特點

故本課題采用益氣養(yǎng)陰組（A 組）、清熱解毒組（B組）及益氣養(yǎng)陰解毒組（C組）分別代表扶正法、祛邪法及扶正祛邪法治則，旨在探究三種不同治則對非小細胞肺癌免疫功能的調(diào)節(jié)作用。研究顯示非小細胞肺癌患者外周血Treg、MDSC 表達水平高于健康人（P＜0.001），說明肺癌患者機體免疫功能較健康人群下降，研究結(jié)果與Wang等[16]的發(fā)現(xiàn)一致，提示免疫逃逸是腫瘤發(fā)病的重要基礎。而扶正祛邪中醫(yī)藥治療可以下調(diào)非小細胞肺癌患者的Treg、MDSC 水平。在不同治則中，清熱解毒方組和益氣養(yǎng)陰解毒方組均能夠顯著降低肺癌患者的Treg、MDSC水平（P＜0.05），而益氣養(yǎng)陰方組對非小細胞肺癌患者外周血Treg、MDSC 無明顯的調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）。三組之間比較，清熱解毒方組對降低肺癌患者的Treg、MDSC 水平更有優(yōu)勢。與相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)一致，抗癌祛邪藥物能夠有效降低腫瘤負荷，逆轉(zhuǎn)引起腫瘤免疫逃逸的細胞免疫功能低下狀態(tài)[16,17]。劉嘉湘認為適度的用抗癌攻伐藥物有助于正氣的恢復，本研究結(jié)果亦證實了劉老師強調(diào)祛邪以扶正的要義所在[4]。Treg、MDSC 在腫瘤免疫指標中具有負向調(diào)控作用，我們研究發(fā)現(xiàn)祛邪與扶正祛邪中藥組對Treg、MDSC 具有調(diào)節(jié)作用，單純“解毒散結(jié)”祛邪中藥復方，可以抑制肺癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞、髓源性抑制細胞等“負向”免疫細胞。而單純扶正中藥對Treg、MDSC 未見明顯調(diào)節(jié)作用，是否單純扶正中藥對腫瘤患者免疫微環(huán)境中的其它指標具有調(diào)控作用，還需進一步擴大樣本量深入研究探討。