從免疫抑制和循環(huán)腫瘤細(xì)胞探討肺癌核心病機(jī)“正虛伏毒”的生物學(xué)基礎(chǔ)＊

衣秀秀，羅 斌，錢芳芳，上官文姬，闕祖俊，李和根＊＊，田建輝,＊＊

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院 上海 200032；2.山東省濰坊市中醫(yī)院 濰坊 261000；3.上海市中醫(yī)藥研究院中醫(yī)腫瘤研究所 上海 200032）

肺癌死亡率居于我國居民癌癥死亡首位，其作為惡性腫瘤中常見的癌癥，嚴(yán)重威脅我國居民身心健康。近年來化療、放療、靶向治療及免疫治療已在NSCLC治療中取得一定進(jìn)展，但臨床獲益仍有限，NSCLC 患者5 年生存率仍低于20%[1]。腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其高死亡率的首要因素，防治NSCLC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是目前中西醫(yī)界共同面對的臨床難題。

轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個(gè)多因子參與且復(fù)雜的病理過程，目前關(guān)于NSCLC預(yù)后研究多著重于腫瘤轉(zhuǎn)移的單一方面，缺乏對參與轉(zhuǎn)移的內(nèi)環(huán)境整體因素（如免疫抑制、高凝狀態(tài)、慢性炎癥、循環(huán)腫瘤細(xì)胞等）在NSCLC預(yù)后中的綜合分析NSCLC 預(yù)后中的綜合分析。田建輝課題組在繼承劉嘉湘先生“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腫瘤發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識，提出“正虛伏毒”為肺癌發(fā)病核心病機(jī)的觀點(diǎn)。因此，本研究分析了NSCLC 患者的免疫細(xì)胞因子、CTC計(jì)數(shù)與無進(jìn)展生存期之間的關(guān)系，以探究NSCLC 患者預(yù)后影響因素，探討“正虛伏毒”病機(jī)的科學(xué)基礎(chǔ)，篩選影響肺癌轉(zhuǎn)移高危因子，明確相關(guān)干預(yù)環(huán)節(jié)，構(gòu)建以預(yù)防為主的肺癌治療核心理念。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象

本課題研究病例來自龍華醫(yī)院腫瘤科住院患者及門診患者。研究對象的收錄時(shí)間為2015 年1 月至2016 年1 月，研究截止至2018 年6 月，共納入NSCLC患者70 例。所有研究對象均告知參加研究的風(fēng)險(xiǎn)及獲益，并簽署知情同意書；該研究取得臨床倫理審批[2018LCSY022]和國際臨床研究注冊[NCT02603003]。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2015 年《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范》[2]的診斷標(biāo)準(zhǔn)；肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)按照IASLC 2009年公布的第七版《肺癌國際分期標(biāo)準(zhǔn)》[3]：

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合原發(fā)性支氣管肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)的NSCLC 病例；②手術(shù)、痰液、纖支鏡毛刷、抽吸、沖洗等獲得組織或細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，病理檢測診斷為非小細(xì)胞肺癌，且TNM分期明確；③預(yù)測患者生存期＞6個(gè)月；④有齊全的病例資料，符合以上所有條件者方可作為納入病例。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①術(shù)后3個(gè)月內(nèi)死亡者（死亡原因包括腫瘤、其他疾病或意外）；②術(shù)中或術(shù)后1 月內(nèi)已復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者；③合并心、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾?。虎芎喜㈧o脈血栓栓塞癥者；⑤伴有其他類型原發(fā)腫瘤者。符合以上任何一條均排除該病例。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集

查閱龍華醫(yī)院電子病例及門診病例記錄，記錄患者一般情況、診斷、臨床分期等內(nèi)容；免疫細(xì)胞因子、循環(huán)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)的臨床檢查記錄，通過住院、門診復(fù)查、電話等方式方法進(jìn)行隨訪，記錄患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移時(shí)間點(diǎn)及具體病情，本研究末次隨訪日期為2018 年6 月1 日，至此仍未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的病例就作為截尾數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計(jì)。以此計(jì)算PFS。

1.2.2 觀察項(xiàng)目

主要觀察患者個(gè)體因素、腫瘤相關(guān)因素、檢驗(yàn)相關(guān)因素以及干預(yù)措施四方面可能影響NSCLC 患者無進(jìn)展生存期的項(xiàng)目，具體如下（表1-2）：

表1 個(gè)體因素、腫瘤相關(guān)因素及賦值

表2 細(xì)胞因子與CTC的分布及賦值

患者個(gè)體因素：包括年齡、性別、家族史、吸煙史、伴隨疾病；

腫瘤相關(guān)因素：包括腫瘤病理類型（腺癌、鱗癌、其他類型非小細(xì)胞癌如大細(xì)胞癌、腺鱗癌等）、臨床TNM分期；

檢驗(yàn)相關(guān)因素：CTC 計(jì)數(shù)按臨床價(jià)值分為2 種亞變量分析方法：第一種以5 為臨界值（參照國際標(biāo)準(zhǔn)Cellsearch 系統(tǒng)）；第2 種以1 為臨界值（分為陰性表達(dá)與陽性表達(dá)）；免疫細(xì)胞因子（INF-γ、TGF-β、VEGF、IL-6、IL-2、sIL-2R）。檢驗(yàn)相關(guān)因素轉(zhuǎn)化為等級資料主要依據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測及其反應(yīng)的臨床意義。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)經(jīng)收集整理，運(yùn)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，運(yùn)用Kaplan-Meier 法進(jìn)行單因素生存分析（設(shè)定有假設(shè)檢驗(yàn)的顯著性水準(zhǔn)定為0.05），選擇Log-rank法進(jìn)行單因素顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

根據(jù)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入NSCLC患者70 例，隨訪開始時(shí)間2015 年1 月，隨訪結(jié)束時(shí)間2018年6 月，共完成隨訪67 例，失訪3 例，隨訪完成率95.7%。共有32例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。納入分析的67例患者的一般情況（表3-5）。

表3 NSCLC患者個(gè)體因素、腫瘤相關(guān)因素

表4 NSCLC患者免疫功能

表5 NSCLC患者CTC計(jì)數(shù)

2.1 相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，故采用Spearman 相關(guān)分析，結(jié)果顯示：CTC 計(jì)數(shù)與IL-6 水平呈正相關(guān)（rs=0.224，P=0.046）；IL-6 水平（rs=-0.267，P=0.026）、sIL-2R水平（rs=-0.252，P=0.035）與PFS呈負(fù)相關(guān)；臨床分期（rs=-0.304，P=0.011）與PFS呈負(fù)相關(guān)；CTC計(jì)數(shù)（rs=-0.278，P=0.020）與PFS呈負(fù)相關(guān)。

2.2 PFS影響因素單因素分析結(jié)果

應(yīng)用Kaplan-Meier 法對67 例患者的無進(jìn)展生存期影響因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果如表所示（表7-9）。其中，病理類型、INF-γ水平、TGF-β水平、VEGF水平、IL-2 水平（圖1、圖2），對NSCLC 患者無進(jìn)展生存期影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。TNM 分期、IL-6水平、sIL-2R水平對NSCLC患者無進(jìn)展生存期影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）（表6-8，圖1-5）。

表6 NSCLC患者PFS影響因素（個(gè)體因素、腫瘤相關(guān)因素）單因素分析

表7 NSCLC患者PFS影響因素（免疫功能）單因素分析

表8 NSCLC患者PFS影響因素（CTC）單因素分析

圖1 不同CTC計(jì)數(shù)（高危組與低危組）的無進(jìn)展生存曲線

圖2 不同CTC計(jì)數(shù)（陽性組與陰性組）的無進(jìn)展生存曲線

圖3 不同臨床分期的無進(jìn)展生存曲線

圖4 不同IL-6水平的無進(jìn)展生存曲線

圖5 不同sIL-2R水平的無進(jìn)展生存曲線

3 討論與分析

原發(fā)性支氣管肺癌發(fā)病率及死亡率在我國及全球居高不下。目前肺癌治療效果不斷改善，但總體五年生存率仍不樂觀（＜20%）[1]。肺癌患者即使接受手術(shù)、化療、放療等，后期仍會發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，約占50%-60%[4]。靶向治療可使局部晚期及轉(zhuǎn)移性NSCLC 患者明顯獲益[5,6]，而早期NSCLC 術(shù)后患者靶向治療療效正處于探索階段。以MAGE-A3 為代表的肺癌免疫治療，其2 期、3 期床試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)能使早中期患者DFS 獲益[7,8]?，F(xiàn)有的預(yù)后評估模型多以腫瘤負(fù)荷或原發(fā)灶細(xì)胞特性為主展開，對引起腫瘤轉(zhuǎn)移的內(nèi)環(huán)境重視不足。因此，明確患者轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)高危因素，并給予積極干預(yù)，具有重要臨床價(jià)值。

3.1 肺癌核心病機(jī)“正虛伏毒”的提出與驗(yàn)證

《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》中云“正氣存內(nèi)，邪不可干；邪之所湊，其氣必虛”。《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·上古天真論》中云“男子……五八腎氣衰。發(fā)墮齒槁?！迸R床上腫瘤的發(fā)病率往往從四十歲以后呈逐漸上升趨勢。《成方便讀·卷一》曰：“凡積之所成，無不由于正氣之虛”，明確指出了積滯的形成來源于正氣的虧虛，而正氣不足正是腫瘤疾病發(fā)病的關(guān)鍵所在?！夺t(yī)宗金鑒》也同樣提出了：“養(yǎng)正積自除”。從治療的角度再次闡述了扶助正氣在腫瘤治療中的重要性。

上世紀(jì)70 年代國醫(yī)大師劉嘉湘先生將中醫(yī)學(xué)理論與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)知識相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂是腫瘤發(fā)病的核心，并強(qiáng)調(diào)通過調(diào)整人體機(jī)能（以免疫調(diào)節(jié)為核心）而增強(qiáng)人體自身抗癌能力，并以此提出“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想[9]，認(rèn)為腫瘤形成主要是由于正氣不足，邪毒乘虛而入，使機(jī)體陰陽失調(diào)，氣血功能障礙，導(dǎo)致氣滯、血瘀、痰凝、毒聚等相互膠結(jié)，日久形成腫瘤[10]。田建輝課題組在“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，融合免疫衰老、免疫逃逸和循環(huán)腫瘤細(xì)胞理論，提出“正虛伏毒”[11]為肺癌發(fā)病核心病機(jī)的觀點(diǎn)，認(rèn)為“正虛”主要指人體免疫衰老、免疫監(jiān)視功能下降和免疫逃逸的發(fā)生；而“伏毒”主要包括癌毒與外邪，如CTC、休眠狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞等。

3.2 IL-6和sIL-2R高表達(dá)介導(dǎo)的免疫抑制是肺癌正虛的重要基礎(chǔ)

免疫抑制是免疫逃逸發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，IL-6、sIL-2R 是常見的免疫抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)IL-6 誘導(dǎo)了肺癌細(xì)胞中的環(huán)氧合酶/前列腺素E2 通路，從而促進(jìn)了連環(huán)蛋白從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[12]。此外，亦發(fā)現(xiàn)IL-6可促進(jìn)乳腺癌、宮頸癌惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而使其具有侵襲、轉(zhuǎn)移能力[13]。EMT 使腫瘤細(xì)胞的自身形態(tài)發(fā)生改變，使細(xì)胞獲得能動(dòng)性，而具有遷移、侵襲能力。Adav A[14]等研究發(fā)現(xiàn)頭頸部惡性腫瘤患者血清IL-6 水平與CTC呈正相關(guān)（n=13，r=0.976，P ＜0.0001）。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者CTC計(jì)數(shù)與血清IL-6呈正相關(guān)（n=70，rs=0.224，P=0.046），這些結(jié)果提示IL-6 在原發(fā)腫瘤細(xì)胞釋放入血，促進(jìn)CTC 形成過程中起著積極作用。此外，孫真等[15]研究發(fā)現(xiàn)高IL-6 組的患者總生存率要差于低IL-6 組的患者(P=0.002)。李玲等[16]發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者血清sIL-2R 水平較高，術(shù)后其水平明顯下降，且發(fā)生癌轉(zhuǎn)移患者sIL-2R 水平更高，預(yù)后不良。Ambrosetti 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在霍奇金淋巴瘤中，sIL-2R水平與臨床分期及腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)（P ＜0.05），且高sIL-2R水平患者治療后效果不佳，更容易進(jìn)展（P=0.004）。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血IL-6 水平（rs=-0.267，P=0.026）、sIL-2R 水平（rs=-0.252，P=0.035）與PFS 呈負(fù)相關(guān)，單因素分析提示IL-6 水平、sIL-2R水平對NSCLC 患者PFS 影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。提示IL-6、sIL-2R的高表達(dá)可能是影響NSCLC患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，對臨床評估及療效評價(jià)具有一定指導(dǎo)意義。

3.3“伏毒”——循環(huán)腫瘤細(xì)胞是肺癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的重要因素肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素

田建輝研究組結(jié)合CTC 產(chǎn)生及致病特點(diǎn)，與中醫(yī)“伏毒”發(fā)病隱匿、病程遷延難愈等致病特點(diǎn)相結(jié)合，創(chuàng)新性地提出“伏毒”在肺癌的轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。

目前FDA認(rèn)證通過Cell Search平臺檢測的CTC技術(shù)來輔助評評估乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌的疾病進(jìn)展的疾病進(jìn)展。2018年美國AJCC指南將CTC納入乳腺癌預(yù)后評估，外周血存在CTC 提示乳腺癌患者預(yù)后不良。2017年美國FDA一項(xiàng)納入5項(xiàng)III期臨床試驗(yàn)，共計(jì)6081 例患者的研究顯示，CTC0（基線≥1，13 周后=0）和CTC conversion(基線≥5，13 周后≤4)可作為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者用藥早期療效評估指標(biāo)，且精準(zhǔn)度較PSA 高[18]。Bing T 等[19]對127 例晚期NSCLC 患者進(jìn)行CTC 檢測（Cyttel CTC 檢測，cut-off 值8）并隨訪，結(jié)果顯示，預(yù)后良好組（CTC＜8）的中位總存活時(shí)間（20.2 個(gè)月vs.10.4 個(gè)月，P＜0.001）及PFS（7.2 個(gè)月vs.5.5 個(gè)月，P=0.009）均明顯長于預(yù)后不良組（CTC ≥8）。HouJ M 等[20]對101 例III 期至IV 期NSCLC 患者檢測治療前CTC 計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)治療前CTC≥50個(gè)組的中位OS低于CTC＜50個(gè)組（5.4個(gè)月VS.11.5個(gè)月)，CTC ≥50個(gè)組的中位PFS組低于CTC＜50個(gè)組（4.6 個(gè)月VS.8.8 個(gè)月)。陳治國等[21]收集59 例NSCLC患者，采用Cell Search系統(tǒng)檢測CTC計(jì)數(shù)并進(jìn)行隨訪，結(jié)果示CTC 陽性組（CTC＞2）比陰性組（CTC ≤1）患者5年總生存率更低（P=0.005），術(shù)后5年累計(jì)復(fù)發(fā)率更高（P=0.022）。

本次研究發(fā)現(xiàn)CTC 計(jì)數(shù)與PFS 呈負(fù)相關(guān)，即CTC計(jì)數(shù)越高，PFS越短。而在單因素相關(guān)分析中，CTC陰性組PFS 尚未達(dá)到，陽性組PFS 為17.00 個(gè)月；CTC 低危組PFS 尚未達(dá)到，高危組PFS 為15.00 個(gè)月，雖然其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為：0.121、0.147），但生存分析圖顯示CTC陰性組及低危組PFS比陽性組及高危組均有延長趨勢，這與上述研究結(jié)論一致。

本研究初步顯示外周血中IL-6 高表達(dá)介導(dǎo)的免疫抑制與循環(huán)腫瘤細(xì)胞的高表達(dá)密切相關(guān)，充分證實(shí)了患者外周血代表的內(nèi)環(huán)境在肺癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。從調(diào)控機(jī)體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)進(jìn)而干預(yù)CTC 的表達(dá)將成為阻斷轉(zhuǎn)移的重要途徑。

本研究僅分析部分免疫細(xì)胞因子及CTC 對NSCLC 預(yù)后的影響，而外周血中同時(shí)存在負(fù)調(diào)控細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞等，后續(xù)有專題介紹），研究可將其納入觀察指標(biāo)，全面評估腫瘤免疫逃逸的發(fā)生環(huán)節(jié)，篩選轉(zhuǎn)移高危因素，以全面認(rèn)識肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵影響因子，提高臨床干預(yù)療效。