長毛風(fēng)毛菊中總香豆素的提取工藝及抗氧化活性研究＊

譚 榮，李本鵬，蔣向輝，王 翔,2

（1.凱里學(xué)院大健康學(xué)院 凱里 556011；2.黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心 凱里 556011）

長毛風(fēng)毛菊又名“莪吉秀”，是藏族民間習(xí)用藥材，主要來源于菊科植物長毛風(fēng)毛菊（Saussurea hieracioides Hook.f.）的干燥全草，主要用于治療水腫，尤其是腎型水腫[1]。長毛風(fēng)毛菊主要含有香豆素類、黃酮類、揮發(fā)油類化合物，其中又以苯丙素類化合物為主，包括茵芋苷、東莨菪苷、7-羥基香豆素、東莨菪內(nèi)酯、咖啡酸、七葉內(nèi)酯、綠原酸等[2,3]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)長毛風(fēng)毛菊在減輕水腫、降低血尿酸含量、抗炎、抗氧化等方面的作用與其中的香豆素類物質(zhì)有關(guān)。其中，7-羥基香豆素能通過增強抗氧化酶的活性，激活Nrf2信號通路保護硫酸葡聚糖鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎[4]，保護HepG2 細胞免受甲基乙醛誘導(dǎo)的毒性[5]，還能與順鉑組成香豆鉑增強順鉑的抗腫瘤作用[6]。七葉內(nèi)酯能靶向抑制Axin2 治療轉(zhuǎn)移性直腸癌[7]，減少DFE/DNCB誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮膚炎癥的癥狀[8]，保護缺血性腦損傷大鼠的神經(jīng)功能[9]。茵芋苷可調(diào)控TGF-β1信號通道，延緩腎臟纖維化，顯著降低模型SD 大鼠的血尿素氮、血清肌酐、尿蛋白的水平[10,11]。

對長毛風(fēng)毛菊的資源研究已表明，其儲量豐富[12]，通過含量測定發(fā)現(xiàn)，香豆素類成分含量較高，茵芋苷含量為0.690-5.27%，東莨菪苷含量為0.230-1.16%，7-羥基香豆素含量為0.270-0.960%[13]。但目前尚缺少對其總香豆素的提取工藝研究和抗氧化活性研究，一定程度上限制了藥材資源的開發(fā)利用。因此，本文通過對提取過程中的相關(guān)因素進行正交試驗，優(yōu)選總香豆素的最佳提取工藝，并通過體外抗氧化實驗，測定其不同極性部位的抗氧化性，為長毛風(fēng)毛菊資源的開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

UV-225 紫外分光光度計（日本島津），電子天平（JA103型上海豪晟科學(xué)儀器有限公司），B-260恒溫水浴鍋，(上海亞榮生化儀器廠)，Exceed-Ad-16超純水機（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司），回流裝置。7-羥基香豆素(供含量測定用，批號為111739-200501，純度≥98%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自中國食品藥品檢定研究院，其他試劑為分析純。

長毛風(fēng)毛菊藥材于2015年采集于四川省阿壩縣，經(jīng)鑒定為菊科植物Saussurea hieracioides Hook.f.的干燥全草。洗凈曬干，粉碎后過40目篩備用。

圖1 不同因素對總香豆素提取率的影響

2 方法與結(jié)果

2.1 總香豆素的測定

2.1.1 供試品溶液的制備

取長毛風(fēng)毛菊藥材粉末1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精確加入50%乙醇溶液20 mL，85°C 回流提取2 h，提取液過濾后，使用95%乙醇定容于250 mL量瓶中，搖勻即得。

2.1.2 對照品溶液的制備

取7-羥基香豆素對照品適量，用95%乙醇溶解并定容于25 mL 量瓶中，制成濃度為0.404 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3 標準曲線的制備

精確量取7-羥基香豆素對照品溶液20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL 分別置于10 mL 量瓶中，用95%乙醇定容至刻度，搖勻。以95%乙醇做空白對照，在325 nm波長處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標，7-羥基香豆素的質(zhì)量濃度為橫坐標做標準曲線，得回歸方程：Y=0.1071X+0.009 447，r=0.999 9。結(jié)果7-羥基香豆素在0.808-8.08 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.4 總香豆素提取率的測定

取長毛風(fēng)毛菊樣品1 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，按不同提取條件進行回流提取，過濾，將所得濾液用95%乙醇定容至250 mL，精確吸取適量樣品溶液，使用95%乙醇稀釋1000 倍，以95%乙醇作參照，在325 nm 波長處測定吸光度。由回歸方程得出溶液中總香豆素的濃度，并計算提取率。

2.2 正交試驗優(yōu)選提取工藝

2.2.1 單因素考察

（1）乙醇濃度對長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)的影響

取長毛風(fēng)毛菊樣品1 g，精密稱定，共6份，分別以30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇按1∶20料液比，在85°C 條件下回流提取2 h，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素吸光度并計算其質(zhì)量分數(shù)，計算提取率。從圖1-A 可知，長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)先與乙醇濃度呈正相關(guān)，乙醇濃度為50%時質(zhì)量分數(shù)達到極大值，隨后兩者呈負相關(guān)?？赡苁且驗殡S著乙醇濃度增加，溶劑極性下降，而一些香豆素苷類難溶于低極性有機溶劑，導(dǎo)致總香豆素的溶解度下降；同時長毛風(fēng)毛菊中脂溶性物質(zhì)溶出增加，也致使其溶解度下降[17]。因此，選取40%，50%，60%濃度三個濃度參加正交設(shè)計。

表1 因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計

表3 方差分析

（2）料液比對長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)的影響

取長毛風(fēng)毛菊樣品1 g，精密稱定，共5份，分別用50%乙醇按料液比為1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60，85°C條件下回流提取2 h，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素吸光度并計算質(zhì)量分數(shù)和提取率。

長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)先與料液比呈正相關(guān)，料液比為1∶40 時質(zhì)量分數(shù)達到極大值，隨后，兩者呈負相關(guān)（圖1-B）。因此，選取1∶30，1∶40，1∶50三個水平參加正交設(shè)計。

（3）提取時間對長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)的影響

取長毛風(fēng)毛菊樣品1 g，精密稱定，共6份，分別用40 mL 的50%乙醇85°C 回流提取0.25 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素吸光度并計算其質(zhì)量分數(shù)。選取提取效果最佳的三個時間進行正交設(shè)計。

長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)與時間呈負相關(guān)，提取0.5 h時質(zhì)量分數(shù)達到極大值圖1-C?？赡苁且驗榭傁愣顾匾蚴軣釙r間過長致使結(jié)構(gòu)被破壞，從而表現(xiàn)為質(zhì)量分數(shù)下降。因此，選取0.5 h，1.0 h，1.5 h三個水平參加正交設(shè)計。

（4）提取次數(shù)對長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)的影響

取長毛風(fēng)毛菊樣品1 g，精密稱定，共5份，用 40 mL的50%乙醇85°C回流提取0.5 h，提取次數(shù)分別為1，2，3，4，5次，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，測定總香豆素吸光度并計算質(zhì)量分數(shù)。選取提取效果最佳的三個次數(shù)進行正交設(shè)計。

長毛風(fēng)毛菊中總香豆素質(zhì)量分數(shù)與提取次數(shù)呈正相關(guān)，但是提取次數(shù)太多，總受熱時間長，引起其結(jié)構(gòu)的破壞，且所需溶劑量過大，不利于濃縮及溶劑回收，造成資源浪費。因此，選取3，4，5 次三個水平參加正交設(shè)計（圖1-D）。

2.2.2 正交實驗設(shè)計

在單因素考察的基礎(chǔ)上，設(shè)置乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）4個因素，因素水平表(表1)。以長毛風(fēng)毛菊中總香豆素提取率為考察指標進行L9(34)正交試驗（表2）。

對正交試驗結(jié)果進行方差分析（表3），發(fā)現(xiàn)F臨界值為19，提取次數(shù)F 比值為1，對提取率的影響最小，提取時間的F 比值為20，對提取率具有顯著性影響。各主次因素依次為：提取時間＞乙醇濃度＞料液比＞提取次數(shù)，其中提取時間對總香豆素質(zhì)量分數(shù)影響比較顯著。由此可以確定最佳提取工藝為：A1B3C2D3，即乙醇濃度為40%、料液比為1∶50、提取5次，每次1 h。

2.2.3 提取工藝驗證

按“2.2.2”項下優(yōu)選出的提取方法制備供試品溶液，即50 mL的40%乙醇85°C回流提取，提取5次，每次1 h，測定總香豆素吸光度并計算其提取率。在優(yōu)選的提取工藝條件下，長毛風(fēng)毛菊中總香豆素的提取率為4.53%，大于正交表中的任一試驗，因此，該工藝可作為其中總香豆素的最佳提取工藝。

2.3 長毛風(fēng)毛菊提取物體外抗氧化研究

2.3.1 溶液的配置

DPPH 標準溶液的制備 精密稱取DPPH 標準品0.020 g 用無水乙醇溶解，定容于10 mL 量瓶，搖勻，低溫保存，備用。臨用時將儲備液稀釋至0.0384 mg·mL-1。

樣品溶液的制備 取長毛風(fēng)毛菊28 g，按照優(yōu)化的提取工藝獲得浸膏。將所得粗提物分散于少量水中，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取三次，每次10 mL，合并萃取液，水浴蒸干，分別得石油醚萃取物（0.287 8 g）、氯仿萃取物（1.315 8 g）、乙酸乙酯萃取物（0.351 1 g）、正丁醇萃取物（1.7118 g）、水殘留物（2.995 6 g）。精密稱取25.0 mg 長毛風(fēng)毛菊不同極性萃取物，用相應(yīng)的萃取溶劑定容至50 mL 量瓶，濃度為0.5 mg·mL-1，用時稀釋成濃度梯度。

另取維生素C對照品25.0 mg，用無水乙醇同法配成對照品溶液。

2.3.2 長毛風(fēng)毛菊不同極性萃取物清除DPPH 自由基能力的測定

精密稱取長毛風(fēng)毛菊不同極性萃取液5 ml 及0.0384 mg·mL-1DPPH 溶液5 ml 加入同一具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置30 min，用相應(yīng)萃取溶劑作參比，于517 nm 波長下測定吸光度。按照公式（1）計算不同萃取部位對DPPH 自由基的清除率[14]。

DPPH自由基清除率%=[1-(A2-A1)/A0]×100（1）

式中：A0為5.0 mL DPPH·溶液加入5.0 mL 無水乙醇后測得的吸光值；A1為5.0 mL 無水乙醇加入5.0 mL樣品液測得的吸光值；A2為5.0 mL DPPH·溶液加入5.0 mL樣品液測得的吸光值。以濃度與自由基清除率作圖，求得清除DPPH的半抑制濃度IC50。

乙酸乙酯萃取物濃度從60 mg·mL-1開始清除率幾乎和Vc 接近，且除了水殘留物外，其他部位隨其濃度的增加，部位清除率逐漸增大，清除率增大的趨勢逐漸減?。▓D2）。不同極性萃取物清除率大小為：Vc（96.28%，IC50=0.19）＞乙酸乙酯萃取物（93.39%，IC50=17.24）＞正丁醇萃取物（99.799%，IC50=34.55）＞氯仿萃取物（52.21%，IC50=112.29）＞水殘留物（53.72%，IC50=223.06）＞石油醚萃取物（18.39%，IC50=2.00×108），均對DPPH自由基有一定的清除能力。當(dāng)濃度達到120 mg·mL-1時正丁醇萃取物對DPPH 自由基的清除能力明顯強于Vc 和乙酸乙酯部位，達到99.79%，而Vc 為公認的抗氧化劑，說明長毛風(fēng)毛菊具有一定程度的抗氧化能力。

同時不同極性萃取物的IC50存在較大的差異，其中乙酸乙酯萃取物的IC50值最小，為17.24 mg·L-1，清除率最大。石油醚萃取物的IC50值最大，為2.00×108mg·mL-1，比氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水殘留物的IC50值要大，清除率最小。。

圖2 長毛風(fēng)毛菊不同極性萃取物對DPPH自由基清除能力

3 結(jié)論與討論

考慮到今后長毛風(fēng)毛菊的資源開發(fā)的安全和經(jīng)濟便捷性，本實驗選擇常用的乙醇回流法進行提取工藝考察。此外，由于長毛風(fēng)毛菊中含有的游離的香豆素類成分易升華，而香豆素苷類，如茵芋苷、東莨菪苷等不具有升華性，且二者在極性上也存在差異，為了提高總香豆素的提取率，對提取液濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)進行單因素考察，確定正交試驗內(nèi)容后進行了工藝驗證，最終建立了長毛風(fēng)毛菊中總香豆素的提取工藝。該提取工藝操作簡便，提取率高，且工藝的穩(wěn)定性，重復(fù)性良好，是提取總香豆素的最佳工藝。

前期的實驗表明，長毛風(fēng)毛菊總香豆素類主要集中在乙酸乙酯部位[2]，因此，為了有效評價長毛風(fēng)毛菊中總香豆素的抗氧化活性，本實驗對長毛風(fēng)毛菊提取物不同極性部位進行體外抗氧化分析。在實驗中考察了DPPH 溶液在室溫避光和曝光下60 min 的穩(wěn)定性，以及儀器精密度。在該條件下，穩(wěn)定性和精密度的RSD%分別為0.45%和0.13%，效果良好。從結(jié)果來看，乙酸乙酯萃取物清除能力最強，提示長毛風(fēng)毛菊的抗氧化性主要來源于其總香豆素。

已有文獻報道，一些天然香豆素類成分通過影響ROS的形成和清除，修復(fù)自由基介導(dǎo)的氧化損傷，起到抗炎、抗誘變、抗腫瘤、神經(jīng)保護作用[15-17]，此外，香豆素還能顯著緩解溴酸評誘導(dǎo)的腎臟毒性，其藥理機制依舊是抗氧化［18］。本文構(gòu)建了高效的長毛風(fēng)毛菊總香豆素的提取工藝，并篩選了不同部位的抗氧化性，這為今后可將長毛風(fēng)毛菊作為天然抗氧化物質(zhì)的良好來源，為研制出高效、低毒的抗氧化藥品提供了可靠的實驗依據(jù)。