芹菜素對肺癌PC9GR細胞侵襲和遷移的抑制作用及機制

李 彬 蔡 悅 陳 匯*

（1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430030；2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北 武漢 430030）

芹菜素 （4'，5，7-trihydroxyflavone，Apigenin，APG），又名芹黃素，是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物如旱芹、洋甘菊、紫蘇、馬鞭草中［1］。國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素是天然抗氧化劑，具有降血壓和舒張血管、預(yù)防動脈粥樣硬化等抗心血管病作用［2］。近年來，芹菜素在抗腫瘤方面的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)和認可。研究表明，芹菜素對乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌等實體腫瘤均具有抑制作用［3-8］。在乳腺癌和肺癌中，芹菜素對一些化療藥物也顯示出增敏或逆轉(zhuǎn)耐藥作用［4，9-10］。與其他黃酮類化合物（槲皮素、山奈黃酮）相比，芹菜素具有低毒、無誘變性等特點［11］。因此，芹菜素作為天然高效且低毒的抗腫瘤藥物，已成為目前腫瘤輔助治療領(lǐng)域的研究熱點之一。本研究在PC9GR細胞中探究芹菜素對肺癌細胞侵襲和遷移能力的影響，并初步研究相關(guān)分子機制，以期為晚期肺癌治療提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 芹菜素（HPLC≥98%，標準品） 購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液購買于Hyclone公司，胎牛血清來自浙江天杭生物科技股份有限公司，CCK-8試劑盒購買于武漢莊盟生物科技有限公司，Transwell板、Matrigel基質(zhì)膠購于美國Corning公司，蛋白提取相關(guān)試劑均來自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。實驗用兔抗人E-cadherin抗體、兔抗人N-cadherin抗體、兔抗人MMP-9抗體、兔抗人MMP-2抗體購買于CST公司，兔抗人Snail抗體、鼠抗人Slug抗體、兔抗人VEGF抗體為美國Santa Cruz公司，鼠抗人 β-actin抗體來自Abbkine，羊抗兔、鼠抗兔IgG購于武漢大風(fēng)生物科技有限公司。本研究所用PC9GR細胞為逐步誘導(dǎo)所得，由我院胸外科實驗室饋贈。實驗用水為超純水，所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察 PC9GR細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將對數(shù)生長期細胞隨機分組，以2×105個/孔接種于六孔板。細胞貼壁24 h后，將孔內(nèi)培養(yǎng)基替換為含藥培養(yǎng)基。實驗組分別加入含有10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培養(yǎng)基，陰性對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，將六孔板置于Olympus IX71倒置顯微鏡白光下觀察細胞形態(tài)，使用Image-Pro Plus IPP 7.0圖象分析軟件對細胞形態(tài)進行圖像采集。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活率 取生長狀態(tài)良好細胞，消化計數(shù)后以3×103個/孔將細胞均勻接種至96孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁24 h后，將各孔培養(yǎng)基替換為含藥培養(yǎng)基。其中10 μmol/L組、20 μmol/L 組分別加入含有 10 μmol/L、20 μmol/L 芹菜素的培養(yǎng)基，陰性對照組加入含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)基，用不含血清的培養(yǎng)基漂洗2遍 。每孔加入 100 μL含10%CCK-8的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用全自動酶標儀在450 nm波長處測量各孔吸光度值，計算細胞存活率。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲和遷移能力 取生長狀態(tài)良好細胞，消化計數(shù)后用無血清的培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整懸液濃度，以每孔5×104個的密度將細胞接種至預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室的上室，下室中加入含藥培養(yǎng)基。10 μmol/L 組、20 μmol/L 組分別加入含 10 μmol/L、20 μmol/L芹菜素的培養(yǎng)基，陰性對照組為含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔，遷移實驗無需鋪膠。將Transwell板置于37℃培養(yǎng)48 h（侵襲實驗） 或24 h（遷移實驗）。細胞侵襲和遷移完成后，用培養(yǎng)基潤濕的棉簽輕輕拭去上室表面的細胞，移出小室。用4%多聚甲醛固定后將小室置于0.1%結(jié)晶紫溶液中，浸潤染色30 min。光學(xué)倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，拍照并統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)目，取平均值。

1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達 采用Western blotting 檢測 E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug、MMP-9、MMP-2及VEGF等相關(guān)蛋白的表達。取對數(shù)生長期細胞，以適當(dāng)密度接種于培養(yǎng)皿。細胞分組及給藥同1.2.1。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集細胞。將培養(yǎng)皿置于冰上，加入適量含PMSF的RIPA細胞裂解液，置于冰上裂解5 min，提取細胞總蛋白液。按 BCA法測定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液，100℃水浴變性。將蛋白樣品進行10%SDS-PAGE電泳后，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入適量一抗稀釋液，4℃孵育過夜。漂洗后加入適量HRP標記的二抗，室溫孵育 2 h后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。結(jié)果采用Gel-Pro圖像分析軟件讀取目的條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參 ，計算目的蛋白與對應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值，將其作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理，本研究實驗均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，組內(nèi)數(shù)據(jù)采用t檢驗分析，組間比較采用ANOVA方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對PC9GR細胞存活率的影響 在PC9GR細胞中加入不同濃度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素處理48 h后，觀察細胞形態(tài)，采用CCK-8法檢測細胞存活率。結(jié)果顯示，和陰性對照組相比，2個濃度組芹菜素作用后PC9GR細胞存活率均有一定程度的降低，其中20 μmol/L組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。芹菜素組PC9GR細胞形態(tài)趨向延展，體積增大，上皮樣特征增強（見圖 1）。

圖1 不同濃度芹菜素對PC9GR細胞形態(tài)和細胞存活率的影響（100×）

2.2 芹菜素對PC9GR細胞侵襲和遷移能力的影響 經(jīng)不同濃度 （10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素處理后，觀察并統(tǒng)計細胞穿膜數(shù)目，以檢測細胞侵襲和遷移能力的變化。如圖所示，和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中細胞穿膜數(shù)目顯著減少（均P＜0.05），細胞侵襲能力降低，并且20 μmol/L組明顯低于10 μmol/L組（圖2.A）。細胞遷移實驗顯示，和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中細胞穿膜數(shù)目也明顯減少（均 P＜0.05），細胞遷移能力降低（圖2.B）。上述結(jié)果提示芹菜素明顯降低PC9GR細胞的侵襲和遷移能力。

圖2 不同濃度芹菜素對PC9GR細胞侵襲（A）和遷移（B）的影響（100×）

2.3 芹菜素對EMT相關(guān)蛋白表達的影響 不同濃度（10 μmol/L、20 μmol/L） 芹菜素干預(yù) 48 h 后，將提取的細胞總蛋白進行Western blot檢測。和陰性對照組相比，10 μmol/L和20 μmol/L芹菜素組中，PC9GR細胞中上皮標志物E-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.05），并且具有濃度依賴性。與EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中，Snail表達顯著減少（P＜0.05）。另外，和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子VEGF蛋白表達也明顯減少（P＜0.05）。在上述濃度芹菜素作用下，PC9GR細胞中間充質(zhì)標志物N-cadherin，轉(zhuǎn)錄因子Slug及金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2的蛋白表達變化均不明顯（P＞0.05）。

圖3 不同濃度芹菜素對EMT相關(guān)蛋白表達的影響

3 討論

肺癌是我國近年來發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤［12］，其死亡率較高的主要原因有容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療抵抗［13-14］。眾所周知，腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強是腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的必要條件，往往伴隨著細胞形態(tài)學(xué)特征的變化［15］。對晚期肺癌患者來說，抑制腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的速度能顯著延長患者的生存期和提升生活質(zhì)量［14，16］。諸多研究表明，芹菜素對卵巢癌、前列腺癌和肝癌等腫瘤都具有抑制侵襲和轉(zhuǎn)移的作用［3，17-19］。芹菜素可抑制肺癌細胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，但其對肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響目前尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)，濃度為10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可顯著抑制肺癌PC9GR細胞的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力。在該作用濃度下，芹菜素對PC9GR細胞的生長僅產(chǎn)生較弱的抑制作用，因而可減少增殖抑制作用對侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。同時，研究發(fā)現(xiàn)芹菜素處理可增強PC9GR細胞的上皮形態(tài)特征，這與上述結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，芹菜素具有抑制肺癌轉(zhuǎn)移的潛力，為晚期肺癌的治療可提供參考。

研究表明，芹菜素可通過上調(diào)PTEN蛋白表達［20］、調(diào)控 Wnt信號通路［21］、影響 Akt信號［7，22］等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究中芹菜素可明顯抑制PC9GR細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，增強其上皮形態(tài)特征，但這些作用是如何產(chǎn)生的尚不清楚。通過檢測PC9GR細胞中EMT標志物及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，我們發(fā)現(xiàn)芹菜素可顯著促進上皮標志物E-cadherin的表達，并且呈濃度依賴性，同時下調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子Snail的蛋白表達。E-cadherin表達增加與細胞上皮樣形態(tài)特征增強是一致的，這進一步證實了芹菜素對侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用。芹菜素干預(yù)對間充質(zhì)標志物N-cadherin及其他下游轉(zhuǎn)錄因子Slug影響不明顯，可能是因為它們不是芹菜素的主要作用靶點。另外，和腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9和血管內(nèi)皮生長因子VEGF蛋白表達也明顯減少。上述結(jié)果表明芹菜素可能通過影響多種信號途徑降低肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。至于芹菜素究竟是如何影響上述蛋白表達的，值得我們進一步研究。有文獻報道E-cadherin在肺癌細胞中的表達具有表觀遺傳調(diào)控的可能［23］，這可能成為我們深入研究的方向。

既往報道表明芹菜素對腫瘤細胞具有多種抗腫瘤作用，而誘導(dǎo)細胞凋亡和增殖抑制作用是芹菜素發(fā)揮抗癌作用的主要途徑。研究表明芹菜素還可抑制結(jié)腸癌SW620細胞和肝癌Hepg2細胞的葡萄糖攝?。?4-25］，干擾其能量代謝，進而影響細胞增殖和凋亡等過程。另外，芹菜素還可通過誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自噬［26］，對抑癌基因的表觀遺傳調(diào)控［27］以及對化療藥物的增敏作用［10］等途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用。腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是肺癌治療的難點之一，PC9GR細胞作為吉非替尼耐藥細胞株，具有較強轉(zhuǎn)移能力，是研究晚期肺癌治療的良好載體。本研究表明10 μmol/L和20 μmol/L的芹菜素可顯著抑制PC9GR細胞的侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力，并且在該較低濃度下不會產(chǎn)生明顯細胞毒性作用，這為芹菜素在肺癌治療中的應(yīng)用又提供了有益參考。結(jié)合芹菜素可抑制乳腺癌和肝癌等多種腫瘤侵襲能力的事實，芹菜素的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用值得深入研究。

綜上，本研究表明芹菜素可抑制肺癌PC9GR細胞的侵襲和遷移能力，并且這可能與上調(diào)E-cadherin的表達，減少Snail、MMP-9以及VEGF的表達有關(guān)。至于芹菜素在體內(nèi)的抗肺癌轉(zhuǎn)移作用如何，以及和其他抗腫瘤藥物的聯(lián)合應(yīng)用，將是我們接下來將要研究的內(nèi)容。