高效液相色譜法測(cè)定生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中N,N′-乙二胺二琥珀酸

吳智超, 吳恩國(guó), 楊仲毅*, 陶宇翔, 陳 潭, 鐘永軍

(1. 臺(tái)州學(xué)院, 浙江 臺(tái)州 318000; 2. 浙江海正藥業(yè)股份有限公司, 浙江 臺(tái)州 318000;3. 臺(tái)州市博納化工有限公司, 浙江 臺(tái)州 318000)

乙二胺二琥珀酸(N,N′-ethylenediamine disuccinic acid, EDDS)是一種天然生物源氨基多羧酸類(lèi)螯合劑,主要用于化妝品、洗滌劑,以及環(huán)保行業(yè)如重金屬污染土壤的修復(fù)等。與乙二胺四乙酸(EDTA)相比,EDDS具有更高的pH耐受性和更好的生物可降解性,是當(dāng)前土壤修復(fù)研究中新一代生物螯合劑[1-4]。EDDS可以采用化學(xué)法、發(fā)酵法、生物轉(zhuǎn)化法進(jìn)行生產(chǎn)[5],其中生物轉(zhuǎn)化法具有較好的環(huán)境兼容性,是國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研發(fā)的方法。在生物轉(zhuǎn)化法中,EDDS裂合酶催化富馬酸與乙二胺,從而合成EDDS;反應(yīng)過(guò)程中富馬酸也較容易形成副產(chǎn)物蘋(píng)果酸(見(jiàn)圖1)。

圖 1 EDDS的生物轉(zhuǎn)化Fig. 1 Biosynthesis of N,N′-ethylenediamine disuccinic acid (EDDS)

EDDS的快速分析是其當(dāng)前研究、生產(chǎn)和應(yīng)用的一項(xiàng)重要任務(wù)。EDDS的檢測(cè)方法主要有鈣螯合值法、比色法、離子色譜-電感耦合等離子體-質(zhì)譜法、氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)[6-8]。土壤修復(fù)中EDDS的檢測(cè)常用到離子交換色譜法和反相HPLC[6,9-11],其中反相HPLC檢測(cè)中,EDDS與流動(dòng)相中的銅鹽形成EDDS-Cu絡(luò)合物,在254 nm處有較強(qiáng)吸收。EDDS生物轉(zhuǎn)化過(guò)程的監(jiān)測(cè),則要求能同時(shí)測(cè)定原料富馬酸、產(chǎn)物EDDS、副產(chǎn)物蘋(píng)果酸,檢測(cè)過(guò)程應(yīng)簡(jiǎn)單快速,并且最好能同時(shí)鑒別類(lèi)似物如EDTA等物質(zhì),這也對(duì)檢測(cè)方法提出了更高的要求。富馬酸、蘋(píng)果酸等有機(jī)酸的常規(guī)檢測(cè)中,離子色譜法是常用的方法[12,13]。在EDDS生物合成研究中,Poddar等[14]采用核磁共振鑒定生成EDDS,并通過(guò)測(cè)定反應(yīng)液在240 nm處紫外吸收的下降來(lái)判斷轉(zhuǎn)化過(guò)程中原料富馬酸的濃度變化。Witschel等[15]利用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定反應(yīng)生成的EDDS,并利用離子排阻色譜法檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中蘋(píng)果酸和富馬酸的濃度。更多的報(bào)道[16,17]則是利用四丁基氫氧化銨作為反相離子對(duì)試劑,HPLC同時(shí)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中富馬酸和EDDS。Kato等[18]利用C8柱,同時(shí)測(cè)定富馬酸、L-蘋(píng)果酸和EDDS。

鑒于C18柱更廣泛的應(yīng)用[19],建立基于C18柱能同時(shí)分析富馬酸、L-蘋(píng)果酸、EDDS的HPLC方法,并能同時(shí)測(cè)定產(chǎn)物的類(lèi)似物EDTA及蘋(píng)果酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)后的典型代謝物檸檬酸的方法,將有利于EDDS生物合成研究的深入開(kāi)展。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Micromass Quattro Micro API液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司); LC3000型HPLC系統(tǒng)(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司),包括P3000高壓輸液泵、UV3000紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)、RPL-D2000型柱溫箱;UV-3300分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司); FA2004B十萬(wàn)分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

甲醇為色譜純,由美國(guó)Fisher公司提供;富馬酸、L-蘋(píng)果酸、磷酸、25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))四丁基氫氧化銨、乙酸銅為分析純,購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EDDS對(duì)照品由臺(tái)州市博納化工有限公司提供,含量為98.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

表達(dá)EDDS裂合酶的基因工程菌來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。該酶的GenBank登錄號(hào)為ABG61966,是一種精氨琥珀酸裂合酶[14,20]。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取乙二胺二琥珀酸三鈉鹽固體粉末305.2 mg,加入約30 mL超純水,超聲5 min,用10 mol/L的氫氧化鈉溶液滴加并調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.5,使EDDS溶解澄清,以去離子水定容至100 mL,得到EDDS標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

稱取富馬酸固體粉末300 mg,加入約30 mL超純水,超聲5 min,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加并調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.5,使富馬酸溶解澄清,以去離子水定容至100 mL,得到富馬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2供試品溶液制備

EDDS的生物合成反應(yīng):在500 mL錐形瓶中加入富馬酸11.6 g、乙二胺鹽酸鹽6.7 g、氫氧化鎂2.9 g,以及去離子水50 mL、工程菌菌體5.0 g,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加調(diào)節(jié)溶液pH至8.8,用去離子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min條件在搖瓶中進(jìn)行反應(yīng)。取反應(yīng)7 d的反應(yīng)液作為樣品1;加入10 g/L的EDDS對(duì)照品于樣品1中,作為樣品2。

EDDS的水解反應(yīng):在500 mL錐形瓶中加入去離子水50 mL、EDDS 1.0 g,用10 mol/L氫氧化鈉溶液滴加調(diào)節(jié)溶液至pH≈8.5,再加入工程菌菌體5.0 g,繼續(xù)以10 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至8.5,并以去離子水定容至100 mL。于30 ℃以200 r/min條件在搖瓶中進(jìn)行反應(yīng),3 h后取樣作為樣品3。

1.2.3樣品處理

移取樣品1、2和3各1.0 mL,加入3 mol/L鹽酸200 μL終止反應(yīng),于5 min后加入3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～9.0,再用去離子水定容至20 mL,繼續(xù)用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度后,移取1.0 mL溶液,以10 000 r/min離心2 min,上清液待HPLC分析。

1.2.4色譜條件

色譜柱為InertSustain AQ-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm,日本島津公司);柱溫為30 ℃;流動(dòng)相為25%(體積分?jǐn)?shù))甲醇水溶液(含1.0 g/L一水乙酸銅、2.0 g/L四丁基氫氧化銨,以磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.80);流速為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.5質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離(ESI-)源;離子源溫度為100 ℃;脫溶劑溫度為300 ℃;毛細(xì)管電壓為3 200 V;錐孔電壓為20 V;氣簾氣為氮?dú)?流量為52 L/h;脫溶劑氣為氮?dú)?流量為650 L/h;檢測(cè)方式為全掃描,掃描范圍為m/z20～800;進(jìn)樣方式為蠕動(dòng)泵直接進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在190～700 nm波段對(duì)0.5 g/L的EDDS溶液進(jìn)行掃描,EDDS在195 nm處有最大吸收峰,而在250 nm之后則基本無(wú)吸收。在溶液中加入1 g/L的一水乙酸銅后再次掃描,EDDS-Cu復(fù)合物在190～285 nm處均有較高的吸收,并于320 nm左右降至接近基線。與EDDS不同,富馬酸的紫外吸收受乙酸銅的影響相對(duì)較小,其富馬酸-Cu復(fù)合物與EDDS-Cu復(fù)合物的掃描曲線基本重疊(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)選擇254 nm作為HPLC的檢測(cè)波長(zhǎng),既保證了EDDS-Cu復(fù)合物有較高的紫外吸收,又可以避開(kāi)游離EDDS對(duì)檢測(cè)的干擾。

圖 2 乙二胺二琥珀酸、富馬酸及其銅復(fù)合物的光吸收曲線Fig. 2 Absorbance curves of N,N′-ethylenediamine disuccinic acid, fumaric acid and their complex with copper salts

2.1.2流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

為開(kāi)發(fā)一個(gè)快速簡(jiǎn)便的HPLC方法,比較了流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)出峰時(shí)間的影響(見(jiàn)圖3)。甲醇體積分?jǐn)?shù)為15%時(shí),EDDS、富馬酸和EDTA的出峰時(shí)間分別為7.5、10.1和11.8 min;甲醇體積分?jǐn)?shù)為35%和50%時(shí),EDDS和富馬酸的出峰時(shí)間雖然大為縮短,但EDTA出峰次序提前,且EDDS與蘋(píng)果酸、檸檬酸及EDTA不能有效分離,不利于副產(chǎn)物和其他雜質(zhì)的分離檢測(cè);甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%時(shí),EDDS、富馬酸及蘋(píng)果酸、檸檬酸和EDTA可基線分離,峰形均較對(duì)稱，其出峰時(shí)間分別為3.3、3.7、4.2、5.2和6.1 min,總出峰時(shí)間在8 min以內(nèi),且在254 nm處均有較為適中的光吸收,較有利于樣品的快速檢測(cè)。

圖 3 流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)HPLC分析的影響Fig. 3 Effect of volume fractions of methanol in the mobile phases on HPLC analysis 1. malic acid; 2. citric acid; 3. EDDS; 4. ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA); 5. fumaric acid.

2.1.3方法的適用性

EDDS、富馬酸及蘋(píng)果酸、檸檬酸和EDTA這5種物質(zhì)的快速分離使得本方法適用于EDDS的多個(gè)研究領(lǐng)域。比如在EDDS的生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵法生產(chǎn)過(guò)程中,除了原料富馬酸、產(chǎn)物EDDS外,富馬酸在微生物富馬酸酶的催化下會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物蘋(píng)果酸(見(jiàn)圖1),蘋(píng)果酸和富馬酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)后容易產(chǎn)生檸檬酸,因而本方法可以用于生物轉(zhuǎn)化和發(fā)酵法生產(chǎn)EDDS的檢測(cè);在工藝過(guò)程中混入EDTA還會(huì)影響EDDS的產(chǎn)品質(zhì)量,在土壤修復(fù)的研究中需要對(duì)比EDTA和EDDS等不同螯合劑的效果,本方法也能有效區(qū)分EDDS和EDTA。

2.2 方法線性范圍、檢出限、精密度及回收率

2.2.1線性范圍和檢出限

精密吸取EDDS和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用去離子水稀釋成0～3 g/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,進(jìn)行HPLC分析。EDDS和富馬酸的質(zhì)量濃度與峰面積的關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖 4 EDDS與富馬酸的質(zhì)量濃度-峰面積關(guān)系曲線Fig. 4 Mass concentration-peak area curves of EDDS and fumaric acid

從圖4可見(jiàn),EDDS在含量較低時(shí)峰面積與質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系較為明顯,隨著質(zhì)量濃度的升高,其線性關(guān)系降低。EDDS在0.06～0.6 g/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, g/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其回歸方程為Y=11 583.0X+123.1,相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5。

樣品中EDDS最大允許質(zhì)量濃度可以根據(jù)流動(dòng)相中銅離子的質(zhì)量濃度進(jìn)行估算。在254 nm處,EDDS基本沒(méi)有光吸收,峰面積主要由EDDS-Cu復(fù)合物引起。本文中流動(dòng)相銅離子濃度為0.5 mmol/L,銅離子與EDDS等物質(zhì)的量形成復(fù)合物,則相應(yīng)色譜峰中EDDS最高濃度也是0.5 mmol/L。在甲醇體積分?jǐn)?shù)為25%的流動(dòng)相中,EDDS峰洗脫液體積為400 μL, HPLC進(jìn)樣體積為20 μL,將EDDS峰形近似作為三角形進(jìn)行估算,則可計(jì)算得到樣品中EDDS的最大允許質(zhì)量濃度為1.791 g/L。即樣品中EDDS質(zhì)量濃度超過(guò)1.791 g/L時(shí)將導(dǎo)致HPLC流動(dòng)相中無(wú)足夠銅離子與EDDS形成復(fù)合物。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合,當(dāng)EDDS質(zhì)量濃度高于1.8 g/L,HPLC的峰面積增長(zhǎng)已趨于非常緩慢的狀態(tài)(見(jiàn)圖4)。

與EDDS不同,富馬酸在反相柱上的分離并不依賴銅復(fù)合物的形成,銅離子的存在不影響富馬酸的紫外吸收。在0.06～1.8 g/L范圍內(nèi),富馬酸的質(zhì)量濃度與峰面積具有較好的線性關(guān)系,其回歸方程為Y=5 013.6X+28.9,r為0.999 5。

通過(guò)逐步稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液,獲得EDDS和富馬酸的檢出限(S/N=3),分別為0.98 mg/L和1.32 mg/L。

2.2.2精密度和穩(wěn)定性

對(duì)0.6 g/L的富馬酸和EDDS樣品進(jìn)行分析,各連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,計(jì)算得富馬酸和EDDS峰面積的RSD分別為0.85%和1.12%(n=6),表明儀器精密度良好。

取樣品2進(jìn)行稀釋,分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算得到EDDS和富馬酸峰面積的RSD分別為0.41%和1.73%(n=6)。結(jié)果表明,供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。當(dāng)供試品溶液繼續(xù)放置20 h和24 h時(shí),EDDS和富馬酸峰面積的RSD分別為0.70%和3.48%(n=8),說(shuō)明EDDS依然相對(duì)穩(wěn)定,而富馬酸則相對(duì)變化較大。

2.2.3回收率

在未添加工程菌的EDDS合成反應(yīng)液中加入EDDS和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定并配制成質(zhì)量濃度均為5 g/L的EDDS和富馬酸混合溶液。取該溶液18份,每份精密量取1.0 mL,分為3組,每組按低、中、高水平分別精密加入相當(dāng)于3.92、4.90、5.88 g/L的EDDS或富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定并計(jì)算回收率(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表 1 EDDS和富馬酸在3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率(n=9)

2.3 EDDS生物合成和水解反應(yīng)樣品的測(cè)定

按照1.2.2和1.2.3節(jié)方法制備供試品溶液并處理樣品,按1.2.4節(jié)色譜條件對(duì)樣品1進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明,富馬酸殘留為7.22 g/L,但產(chǎn)物EDDS含量?jī)H為0.25 g/L,副產(chǎn)物蘋(píng)果酸達(dá)到了36.56 g/L。將該樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析,質(zhì)譜圖中m/z為133的信號(hào)較高,進(jìn)一步證實(shí)該副產(chǎn)物為蘋(píng)果酸(見(jiàn)圖5)。

圖 5 EDDS生物合成樣品的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 5 Chromatogram and MS spectrum of the EDDS biosynthesis sample

上述HPLC測(cè)定結(jié)果表明,該基因工程中的EDDS裂合酶催化EDDS合成活性較低。由于該酶催化的反應(yīng)為可逆反應(yīng),為驗(yàn)證該基因工程菌表達(dá)的酶是否有活性,重新設(shè)計(jì)了以EDDS為底物的水解反應(yīng)。以10 g/L EDDS為底物,經(jīng)過(guò)工程菌水解3 h,得到樣品3,并進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得蘋(píng)果酸、EDDS的含量分別為3.05 g/L和6.76 g/L,未能檢測(cè)到典型的富馬酸峰。由于EDDS需要先在EDDS裂合酶催化下形成富馬酸,再在富馬酸酶作用下形成蘋(píng)果酸(見(jiàn)圖1),因而推測(cè)該基因工程菌表達(dá)的EDDS裂合酶具有催化活性,同時(shí)該工程菌宿主菌中具有較高的富馬酸酶活性。

3 結(jié)論

本文建立的反相離子對(duì)色譜法可以快速同時(shí)分離蘋(píng)果酸、檸檬酸、EDDS、EDTA和富馬酸,為EDDS生物合成機(jī)理和工藝開(kāi)發(fā)提供了有效的分析技術(shù)支持。

致謝 本文的質(zhì)譜分析得到普濟(jì)生物科技(臺(tái)州)有限公司徐剛博士的支持。