分散固相萃取結(jié)合氣相色譜-高分辨質(zhì)譜快速篩查醬油中多種氯丙醇

黃超群, 陳欽可, 陳 麗, 王云宇, 馬 喆, 沈 咪, 黃佳波

(浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院, 浙江 杭州 310016)

隨著人們生活水平的提高,調(diào)味品的需求量大大增加,傳統(tǒng)的通過長時(shí)間微生物發(fā)酵、水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)得到的調(diào)味品已無法滿足需求,隨之產(chǎn)生了添加水解植物蛋白質(zhì)的復(fù)合調(diào)味品,其中就包含配制醬油。水解植物蛋白質(zhì)是植物性蛋白質(zhì)在鹽酸催化及高溫條件下水解后的產(chǎn)物。其水解速度快,可極大縮短生產(chǎn)周期,降低成本;同時(shí)水解植物蛋白質(zhì)中含有的氨基酸系列物質(zhì),能增加食品中的營養(yǎng)成分。但是,在酸水解過程中發(fā)生的副反應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生3-氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)等氯丙醇類物質(zhì)[1,2]。這類物質(zhì)具有致癌性,也會(huì)引起不育癥,其中以3-MCPD的毒性最大。因此,各個(gè)國家、組織對(duì)調(diào)味品中3-MCPD都著有嚴(yán)格的限量規(guī)定:我國[3]與國際食品法典委員會(huì)(CAC)[4]對(duì)于添加了酸水解植物蛋白質(zhì)的液態(tài)調(diào)味品中3-MCPD規(guī)定的限量為0.4 mg/kg;歐盟[5]對(duì)于3-MCPD在水解植物蛋白質(zhì)及醬油中的限量更為嚴(yán)格,均為0.02 mg/kg。

目前,食品中氯丙醇的檢測通常采用固相萃取凈化,用七氟丁酰咪唑等衍生試劑將氯丙醇衍生后,利用氣相色譜-質(zhì)譜法[2,6-9]或氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]進(jìn)行測定。在此類方法中,衍生步驟復(fù)雜,衍生物穩(wěn)定性較差,給氯丙醇的準(zhǔn)確測定帶來了一定難度。同時(shí),衍生試劑昂貴,增加了檢測成本。因此,有研究人員嘗試采用非衍生化法測定氯丙醇的含量,且已有文獻(xiàn)報(bào)道采用固相萃取[11]或在線凝膠色譜[12]凈化后,用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜非衍生化法測定氯丙醇的方法。

相較于固相萃取或凝膠色譜凈化方法,分散固相萃取是一種更為快速、簡便的前處理方法。分散固相萃取結(jié)合具有高質(zhì)量精度、高通量等優(yōu)勢的高分辨質(zhì)譜技術(shù),已在食品殘留分析檢測領(lǐng)域得到應(yīng)用[13-16],而其應(yīng)用于食品中氯丙醇含量的測定方法未見報(bào)道?；诖?本研究采用分散固相萃取進(jìn)行前處理,應(yīng)用氣相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù),實(shí)現(xiàn)了醬油中4種氯丙醇含量的同時(shí)快速篩查檢測。本文建立的方法具有前處理易操作、定性定量準(zhǔn)確等特點(diǎn),滿足日常醬油中多種氯丙醇含量的檢測需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

PEGASUS GC-HRT氣相色譜-高分辨質(zhì)譜儀,配電子轟擊源(美國Leco公司); AE260電子天平(瑞士Mettler公司); YP502N電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司); MS3 BASIC渦旋混合器(德國IKA公司); P300H超聲波清洗器(德國ELMA公司); N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化器械株式會(huì)社); MULTIFUGE X1R離心機(jī)、SORVALL LEGEND MICRO 17R離心機(jī)(美國Thermo公司)。

1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP,純度99.6%)、五氘代2,3-二氯-1-丙醇(D5-2,3-DCP,純度98.0%)、五氘代2-氯-1,3-丙二醇(D5-2-MCPD,純度98.0%)購自北京曼哈格生物科技有限公司;2,3-二氯-1-丙醇(2,3-DCP,純度98.0%)、2-氯-1,3-丙二醇(2-MCPD,純度98.0%)購自加拿大TRC公司;3-MCPD(純度99.3%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司;五氘代1,3-二氯-2-丙醇(D5-1,3-DCP,純度99.2%)、五氘代3-氯-1,2-丙二醇(D5-3-MCPD,純度97.5%)購自加拿大CDN公司;乙酸乙酯(色譜純)購自西班牙Scharlau公司;N-丙基乙二胺(PSA)購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取氯丙醇及氘代氯丙醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 mg,用乙酸乙酯溶解,分別轉(zhuǎn)移至8個(gè)50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,搖勻,配制成濃度為200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確移取25 μL 1,3-DCP、50 μL 2,3-DCP、250 μL 2-MCPD和500 μL 3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成3-MCPD質(zhì)量濃度為10 mg/L的氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液;準(zhǔn)確移取25 μL D5-1,3-DCP、50 μL D5-2,3-DCP、250 μL D5-2-MCPD和500 μL D5-3-MCPD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至同一10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制成D5-3-MCPD質(zhì)量濃度為10 mg/L的氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)工作液

準(zhǔn)確移取氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液20、50、100、200和500 μL于10 mL容量瓶中,分別加入100 μL氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液,用乙酸乙酯定容,配制成3-MCPD質(zhì)量濃度分別為20、50、100、200和500 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

稱取2 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加入10 μL氘代氯丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)中間液和20 mL乙酸乙酯,渦旋0.5 min,超聲10 min,以4 000 r/min的速度離心3 min,移取上層溶液至150 mL濃縮瓶。下層殘余物用20 mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次,合并乙酸乙酯層至同一濃縮瓶中,于40 ℃濃縮至近干,用乙酸乙酯定容至1 mL,待凈化。

1.3.2凈化

將上述溶液轉(zhuǎn)移至裝有150 mg PSA的1.5 mL離心管中,渦旋1 min,以10 000 r/min的速度離心3 min。取上清液,過膜后供氣相色譜-高分辨質(zhì)譜儀檢測。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫:初始100 ℃,保持2.0 min,以15 ℃/min的速率升溫至220 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度:230 ℃;傳輸線溫度:250 ℃;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流量為1.5 mL/min;進(jìn)樣量:2.0 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣。

圖 2 醬油樣品中3-MCPD的選擇離子色譜圖Fig. 2 SIM chromatograms of 3-MCPD in soy sauce sample a. m/z 43.0182; b. m/z 44.0258; c. m/z 61.0285; d. m/z 78.9944; e. m/z 79.

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電子轟擊(EI)源;電離能量:70 eV;離子源溫度:200 ℃;分辨率:≥20 000;溶劑延遲:5.0 min; 4種氯丙醇及其同位素內(nèi)標(biāo)監(jiān)測離子保留時(shí)間、質(zhì)荷比信息見表1。

表 1 4種氯丙醇及其同位素內(nèi)標(biāo)監(jiān)測參數(shù)

圖 1 3-MCPD的全掃描質(zhì)譜圖Fig. 1 Full scan spectrum of 3-MCPD

2 結(jié)果與討論

2.1 監(jiān)測離子質(zhì)荷比的確定

按1.4節(jié)方法分別對(duì)4種10 mg/L氯丙醇及同位素內(nèi)標(biāo)進(jìn)行高分辨質(zhì)譜全掃描,獲得目標(biāo)物的保留時(shí)間、碎片離子等信息,選擇一個(gè)靈敏度高、干擾少的碎片離子作為目標(biāo)物的定性、定量離子。圖1為3-MCPD的全掃描高分辨質(zhì)譜圖,對(duì)其各主要碎片離子在實(shí)際樣品中的靈敏度及其干擾情況進(jìn)行考察,結(jié)果如圖2a～2d所示。質(zhì)荷比為78.994 4的離子相較于其他離子具有更高的信噪比,而且受干擾也少。若采用普通低分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測,碎片離子m/z79受到較大干擾,無法準(zhǔn)確定性和定量(見圖2e),因此選擇m/z78.994 4作為3-MCPD的高分辨質(zhì)譜監(jiān)測離子。同樣地,確定了其他3種氯丙醇的監(jiān)測離子,詳見表1。

表 2 4種氯丙醇化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量限

Y: peak area ratio of chloropropanols and their isotope internal standards;X: mass concentration of chloropropanols (μg/L).

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

4種氯丙醇類化合物溶于甲醇、乙腈、乙醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑,實(shí)驗(yàn)中選用乙腈、乙酸乙酯作為提取劑,通過加標(biāo)回收試驗(yàn),比較了2種提取劑對(duì)氯丙醇類化合物的提取效果。結(jié)果表明,乙腈、乙酸乙酯對(duì)氯丙醇類化合物的提取效率均在90%以上,然而采用乙腈作為提取液時(shí)帶入了更多的雜質(zhì)。圖3a和3b為采用2種提取劑處理后的醬油樣品的總離子圖,采用乙腈作為提取液,總離子圖上雜質(zhì)峰明顯多于乙酸乙酯。因此,本研究采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.3 分散固相萃取條件的優(yōu)化

醬油的成分復(fù)雜,包含多種氨基酸、糖類、有機(jī)酸、色素及香料等成分。而PSA作為一種凈化劑,常被用于分散固相萃取方法以除去樣品中糖類、有機(jī)酸和色素[17],因此本研究考察了PSA對(duì)于醬油的凈化效果,并對(duì)其用量進(jìn)行優(yōu)化。

為確定提取后樣液中存在的主要雜質(zhì),對(duì)大量未經(jīng)凈化的樣液進(jìn)行了篩查。結(jié)果表明,樣品總離子圖上主要存在兩個(gè)明顯的雜質(zhì)峰(見圖3b)。對(duì)其質(zhì)譜圖分析得出,兩種化合物分別為乙酰丙酸(Peak 1)和苯甲酸(Peak 2)。乙酰丙酸也是植物蛋白質(zhì)酸水解發(fā)生的副反應(yīng)產(chǎn)物[18],而苯甲酸是一種醬油中常用的防腐劑,GB 2760-2014規(guī)定醬油中苯甲酸限量為1.0 g/kg。PSA的加入,能有效祛除醬油提取液中這兩種化合物(見圖3c和3d)。對(duì)其用量優(yōu)化表明,當(dāng)PSA用量為150 mg時(shí),所篩查醬油樣品中乙酰丙酸和苯甲酸能被完全祛除。因此,本研究確定的PSA用量為150 mg。

圖 3 不同處理?xiàng)l件下醬油樣品的總離子圖Fig. 3 Total ion chromatogram of soy sauce sample treated under different conditions a. Extracted by acetonitrile, without clean-up; b. extracted by ethyl acetate, without clean-up; c. extracted by ethyl acetate, treated with 50 mg N-propylethylenediamine (PSA); d. extracted by ethyl acetate, treated with 150 mg PSA. Peak 1. levulinic acid; peak 2. benzoic acid.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍和定量限

在確定的色譜和質(zhì)譜條件下,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定,以氯丙醇化合物質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)、氯丙醇化合物與其同位素內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,4種氯丙醇化合物線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.999,其線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)詳見表2。同時(shí),根據(jù)樣液中4種氯丙醇化合物的響應(yīng)情況,確定了醬油中4種氯丙醇化合物各自的定量限(S/N≥10),滿足國內(nèi)外對(duì)于3-MCPD的限量要求。

2.4.2回收率和精密度

在空白醬油樣品中分別添加3個(gè)濃度水平的4種氯丙醇化合物,每個(gè)濃度水平重復(fù)測定6次,計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表3所示,醬油中4種氯丙醇化合物的回收率范圍為78%～103%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于8.8%。本方法能夠滿足醬油中4種氯丙醇快速篩查檢測的要求。

表 3 醬油中4種氯丙醇的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測

采用本方法與標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.191-2016(第二法)對(duì)3-MCPD檢出的樣品進(jìn)行測定,兩種方法的檢測結(jié)果基本一致(見表4)。相較于GB 5009.191-2016,本方法無需固相萃取凈化及衍生化反應(yīng),更為簡便快速,試劑耗材成本更低。

表 4 采用不同方法的3-MCPD測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種分散固相萃取結(jié)合氣相色譜-高分辨質(zhì)譜測定醬油中4種氯丙醇的分析方法。

該方法實(shí)驗(yàn)過程不涉及復(fù)雜的樣品前處理過程,簡單、快速、高效,準(zhǔn)確度、靈敏度、精密度均較高,能滿足日常醬油中4種氯丙醇的快速定性篩查和定量測定。