分光光度法測定金櫻子果中總皂苷的含量

彭焱輝，楊 熙，王志強(qiáng)，葉建斌，徐陽純，林 晨

( 中國廣州分析測試中心，廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070 )

金櫻子，中藥名。為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx.的干燥成熟果實(shí)。分布于陜西、安徽、江西、江蘇、浙江、湖北、湖南、廣東、廣西、臺灣、福建、四川、云南、貴州等地[1-2]。

金櫻子根皮提制拷膠.果實(shí)入藥，有利尿、補(bǔ)腎作用.葉有解毒消腫作用.根藥用，能活血散瘀、抜毒收釣、祛風(fēng)駔濕。扦插或用種子繁殖.對土壤要求不嚴(yán)，宜生于陽坡。果實(shí)含維生素、蘋果酸、枸樽酸、鞣質(zhì)、皂甙等，具有廣泛的生理活性，如抗炎、抑菌、降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化等作用。金櫻子的也適于軟硬糖、果汁、汽水、果子露、氣酒、香鉺等著色產(chǎn)品開發(fā)[3-4]。金櫻子野生資源豐富、生長快，也易于栽培，是一種理想的、具有開發(fā)利用潛力的天然果汁飲品原料。

皂苷是天然產(chǎn)物化學(xué)庫的重要組成之一，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗真菌、殺精子、保肝活性等[5-7]。特別有些皂苷還具有抗菌的活性或解熱、鎮(zhèn)靜、抗癌等有價(jià)值的生物活性，為保健功效重要成分。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定金櫻子果中總皂苷含量[8-12]，為深入研究與開發(fā)金櫻子果的藥用和保健功效價(jià)值提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 主要材料

產(chǎn)地為江西、廣東、廣西、湖北金櫻子果烘干、粉碎、過篩保存，人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)對照品：中國食品藥品檢定研究所(含量為91.7%)、冰醋酸、香草醛、 高氯酸、無水乙醇和無水甲醇等均為分析純，實(shí)驗(yàn)室用水為去離子水。

1.2 主要儀器

UV-2450紫外可見分光光度計(jì):日本島津公司，電熱恒溫水浴鍋:上海一恒科學(xué)儀器有限公司，電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司，電子天平:Sartorius ，高速多功能粉碎機(jī):永康市久品工貿(mào)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與分析

2.1 試樣液制備

準(zhǔn)確稱取各產(chǎn)地金櫻子果試樣1g于100mL容量瓶中，加入蒸餾水80mL，超聲提取1h。室溫冷卻后，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻，作為供試液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備

稱取0.02269g含量為91.7%的人參皂苷Re對照品，置100mL容量瓶中，用無水甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成約0.2080mg/mL的人參皂苷Re對照品儲(chǔ)備液。

2.3 測定波長的選擇

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于10mL比色管中，水浴蒸干，加入0.2mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)比色管，使殘?jiān)既芙?，再加?.8mL高氯酸輕輕振蕩，于60℃水浴加熱10min，取出，冰浴冷卻后，準(zhǔn)確加入冰乙酸5.0mL，搖勻，用1cm比色池在可見光區(qū)進(jìn)行掃描，掃描波長見圖1，確定最大吸收波長546nm。

圖1 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液的掃描波長Fig.1 Scanning wavelength of ginsenoside Re standard solution

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

分別吸取配制好的對照品使用溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL于7個(gè)比色管中，按2.3操作靜待顯色劑反應(yīng)，在546nm測定其吸光度值。所得數(shù)據(jù)回歸處理。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合曲線見圖2，回歸方程為：Y= 3.6402x + 0.0287。式中：x為被測樣品中人參皂苷Re的質(zhì)量；y為吸光度，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。該分析方法線性關(guān)系良好，可以進(jìn)行定量分析。

圖2 人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)溶液線性擬合曲線Fig.2 Linear fitting curve of ginsenoside Re standard solution

2.5 試樣測定

取適量樹脂于燒杯中，加入無水乙醇覆蓋樹脂，緩慢攪拌樹脂后靜置30min后，過濾出樹脂，用蒸餾水沖洗樹脂至濾液無醇味，重復(fù)洗脫樹脂兩次。

圖3 不同產(chǎn)地金櫻子果總皂苷含量Fig.3 Total saponin content of Rosa laevigata from different habitats

選取層析柱，裝入3cm預(yù)處理好的大孔樹脂，再上加1cm中性氧化鋁。精確加入1.0mL已處理好各產(chǎn)地的金櫻子果試樣溶液2.1，用25mL水過柱，棄去洗脫液，再用25mL70%乙醇洗脫液洗脫人參皂苷，收集洗脫液于蒸發(fā)皿中，置于60℃水浴揮干，按2.3操作靜待顯色劑反應(yīng)，在546nm測定其吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出試樣中含有總皂苷含量。分析得出不同產(chǎn)地含量如圖3，產(chǎn)自江西的金櫻子果總皂苷含量為2.32mg/g，廣東為3.58mg/g，廣西為3.25mg/g，湖北為2.65mg/g。

2.6 精密性試驗(yàn)

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6mL分別在不同日期，不同人員，不同儀器的情況下按2.3操作兩次，在546nm下測定吸光度，計(jì)算六個(gè)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表1。

表1 測定方法的精密性Table 1 The precision of the assay method

結(jié)果顯示RSD=0.87%，精密性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配置好的標(biāo)準(zhǔn)溶液0.6mL按2.3操作后，分別穩(wěn)定10、20、30、40、50、60min后，在546nm下測定吸光度，結(jié)果如表2。

表2 測定方法的穩(wěn)定性Table 2 The stability of the assay method

結(jié)果顯示在60min內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD=0.43%，具有較好的穩(wěn)定性。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的方法對同一批次的金櫻子果進(jìn)行六次測定，計(jì)算六個(gè)測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 測定方法的精密性Table 3 Intermediate precision of the determination method

從表3得出：RSD值0.85%，符合一般方法的RSD<5%的要求，該方法具有很好的重復(fù)性。

2.9 加標(biāo)回收率測定

稱取樣品1.0g(精確到0.0001g)，共稱取12個(gè)，每四個(gè)為一組一共三組，每組保留一個(gè)不加標(biāo)，另外三個(gè)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。樣品稱取后，按試驗(yàn)方法處理后按2.5操作，于樣品中分別加入相當(dāng)于樣品含量的80%，100%，120%的人參皂苷Re對照品，按試驗(yàn)方法處理進(jìn)行比色測定，即進(jìn)行三組不同濃度的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of recovery rates

從表4可知，此三組不同濃度的平均加標(biāo)回收率分別為97.3%、98.1%、97.6%，滿足一般檢測方法對回收率90%～110%要求。

3 結(jié)論

以大孔樹脂對金櫻子果試樣溶液總皂苷分離純化，用70%乙醇溶液作為洗脫液進(jìn)行提取，通過皂苷在強(qiáng)氧化性酸的作用下脫氫，再與香草醛成顯色，采用人參皂苷Re作為對照品，用分光光度法是測定金櫻子果中總皂苷的含量。該方法精密性、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，滿足樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，通過方法能很好的測得不同產(chǎn)地的金櫻子果中總皂苷含量，其中產(chǎn)自廣東的金櫻子果總皂苷含量最高為3.58mg/g，江西產(chǎn)地的金櫻子果總皂苷最低為2.32mg/g。