表達HSA/IL2的重組CHO細胞的無血清培養(yǎng)基優(yōu)化研究

繆亞娜， 熊文典， 萬愛妮， 張晶晶， 蔡燕飛， 陳 蘊， 金 堅*

(1.江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

白介素是一種由人白細胞分泌的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的細胞因子[1]。近20年，IL2在治療腫瘤、黑色素瘤、腎炎[2]、肝炎以及免疫缺陷性疾病[3]中取得顯著效果。但由于IL2相對分子質(zhì)量小，體內(nèi)半衰期短[4]以及具有一定的免疫源性甚至會引起過敏反應(yīng)等因素，IL2的藥物利用率低，患者需頻繁注射，限制了IL2的應(yīng)用。HSA融合技術(shù)實現(xiàn)了各種人源藥物蛋白質(zhì)分子與HSA蛋白質(zhì)的融合表達[5-6]。雷建勇等[7]構(gòu)建pPIC9K-HAS/IL2質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母，純化得到HAS/IL2融合蛋白不僅蛋白活性好，而且有效延長蛋白質(zhì)半衰期至12.34 h。后期研究中發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母表達HSA融合蛋白時存在蛋白質(zhì)降解、產(chǎn)物不均一和過度糖基化等現(xiàn)象，這些不利因素限制了畢赤酵母表達IL-2融合蛋白的應(yīng)用。中國倉鼠卵巢細胞 （Chinese hamster ovary cells，CHO Cells）不僅具有重組基因高效表達能力，而且可精確轉(zhuǎn)錄翻譯、折疊蛋白質(zhì)，并能保證蛋白質(zhì)的充分糖基化[8]，成為重組糖基化蛋白生產(chǎn)的首選體系。盧慧惠等[9]構(gòu)建pMH3-HAS-IL2質(zhì)粒，并電轉(zhuǎn)入CHO細胞，篩選出表達HSA/IL2的CHO細胞株，經(jīng)搖瓶流加培養(yǎng)及純化獲得活性較好的HSA/IL2融合蛋白，解決了融合蛋白的降解和糖基化等問題。但CHO細胞培養(yǎng)仍有問題急需解決，如細胞生長密度低（最高生長密度僅為6.0×106cells/mL）、HSA/IL2表達量低（僅為53 mg/L）等。

懸浮培養(yǎng)是哺乳動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究和應(yīng)用的重要模式和首要選擇[10]。傳統(tǒng)的培養(yǎng)基通常按一定比例加入血清或者組織提取物，然而細胞只能在無血清或含血清替代物的培養(yǎng)基中才能實現(xiàn)懸浮狀態(tài)。隨著對動物細胞培養(yǎng)技術(shù)研究的深入和藥品安全性標準的提高，基于細胞和產(chǎn)品特性的無血清培養(yǎng)技術(shù)的研究受到關(guān)注[11]。目前，雖然無血清培養(yǎng)基的開發(fā)取得一定的成果，但因細胞株的個性化問題，商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基仍不能滿足特定細胞株的高密度生長和產(chǎn)物高表達需求。因而，優(yōu)化適合特定細胞株生長和表達的低成本無血清培養(yǎng)基成為細胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵問題之一。蛋白質(zhì)水解物不僅含有多肽物質(zhì)，而且含有氨基酸、糖類、脂類、礦物質(zhì)和維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)[12]，對細胞生長代謝、凋亡及產(chǎn)物表達等生命活動產(chǎn)生特殊的調(diào)控作用。培養(yǎng)基中添加蛋白質(zhì)水解物還是一種快捷而有效的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，可快速獲得較好的培養(yǎng)基配方，顯著縮短培養(yǎng)基優(yōu)化時間，降低優(yōu)化成本，因而被廣泛應(yīng)用于動物細胞培養(yǎng)領(lǐng)域

本文中評估了3種蛋白質(zhì)水解物，分別為：胰蛋白胨 （動物水解物）、酵母提取物 （微生物水解物）、大豆蛋白胨（植物水解物），作為培養(yǎng)基添加劑對CHO細胞生長、細胞活率、目的蛋白HSA/IL2表達、細胞周期及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

表達HSA-IL2融合蛋白的CHO-S細胞株由本實驗室前期構(gòu)建。

1.2 主要試劑

酵母提取物（YE）、大豆蛋白胨（Soytone）及胰蛋白胨（Tyrtone），均購自上海生工生物有限公司；M1為無血清懸浮培養(yǎng)基、M1及補料培養(yǎng)基Feed 3，均購自蘇州康聚生物有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

分批培養(yǎng)：將細胞以2×106cells/mL的密度接種于150 mL搖瓶，培養(yǎng)體積30 mL，置于37℃、100 r/min的搖床中培養(yǎng)。

流加培養(yǎng)：將細胞以2×106cells/mL的密度接種于250 mL搖瓶，培養(yǎng)體積50 mL。細胞培養(yǎng)至第3天時流加補料培養(yǎng)基Feed 3，并維持葡萄糖質(zhì)量濃度為2~3 g/L。第4天，培養(yǎng)溫度降至34℃，細胞活率在80%時結(jié)束培養(yǎng)。

1.4 分析方法

1.4.1 細胞密度及活力的檢測 細胞自動計數(shù)儀，美國Nexcelom Cellometer公司產(chǎn)品，采用臺盼藍染色法，測定細胞密度及活率并繪制細胞生長及活率曲線。

1.4.2 融合蛋白質(zhì)量濃度測定 尿微量白蛋白測定試劑盒，購自上海名典生物有限公司。

1.4.3 細胞周期測定 取5×105個活細胞，4℃、1000 r/min離心5 min，棄上清液。PBS洗滌2次，加入1 mL冰乙醇，-20℃冰箱保存過夜。離心收集細胞，加入溴化乙錠（PI），使用流式分析儀進行分析。流式分析儀，購自BD公司。

1.4.4 細胞凋亡測定 FITC Annexin V凋亡測定試劑盒，購自BD公司，用于檢測細胞凋亡。

1.4.5 滲透壓測定 滲透壓測定儀，購于天津天河儀器有限公司，測定培養(yǎng)基滲透壓。

1.4.6 氨基酸分離測定 Agilent-1260型高效液相儀分析氨基酸種類濃度；柱型：Venusil AA，5 um，4.6×250 mm。18種常見氨基酸標品，購自美國Wako公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 分批培養(yǎng)篩選最優(yōu)水解物質(zhì)量濃度

不同種類及不同質(zhì)量濃度的水解物對細胞生長及產(chǎn)物表達有較大影響[13]。為了研究不同水解物對CHO細胞生長及HSA/IL2表達的影響，以M1為對照組（0 g/L 組），3 種水解物（Soy、Tyr、YE）及其不同終質(zhì)量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0 g/L）為實驗組。 結(jié)果顯示，與0 g/L組相比，3種水解物均可提高細胞密度；Soy組和低質(zhì)量濃度 YE、Tyr組 （1.0、2.5 g/L）提高細胞密度（圖 1（a））和 HSA/IL2表達量（圖 1（b））作用不明顯；高質(zhì)量濃度 YE、Tyr組（5.0、10.0 g/L）提高細胞密度和HSA/IL2表達量作用明顯且結(jié)果相近；5.0 g/L YE組提高HSA/IL2表達量作用最好。

圖1 不同水解物及其質(zhì)量濃度對細胞密度及目的蛋白表達量影響Fig.1 Effects of hydrolysate concentration on cell density and HSA/IL2 production

為了對比不同水解物及其不同質(zhì)量濃度對細胞密度和HSA/IL2表達量的作用差異，以Cmax/C0（添加不同質(zhì)量濃度水解物組最高細胞密度與對照組最高細胞密度比值）和Mmax/M0（添加不同質(zhì)量濃度水解物組最高目的蛋白表達量與對照組最高目的蛋白表達量比值）為指標，比值越大，提高細胞密度或HSA/IL2表達量作用越明顯，以此確定水解物最優(yōu)質(zhì)量濃度。

表 1 YE 組 Cmax/C0、Mmax/M0比值Table 1 Cmax/C0、Mmax/M0of YE group

如表1所示 （YE組為例），5.0 g/L組的Cmax/C0及Mmax/M0最大，分別為1.4和2.15，說明5.0 g/L YE提高細胞密度和HSA/IL2表達量作用最明顯。因此選擇5.0 g/L YE為最優(yōu)添加質(zhì)量濃度，并進行流加培養(yǎng)實驗。（Tyr和Soy組最優(yōu)水解物質(zhì)量濃度均為5.0 g/L）

2.2 流加培養(yǎng)過程中水解物對細胞生長及目的蛋白表達的影響

流加培養(yǎng)是以分批培養(yǎng)為基礎(chǔ)，依據(jù)細胞代謝情況補加補料培養(yǎng)基。流加培養(yǎng)一方面可以有效解決營養(yǎng)限制和毒副產(chǎn)物積累問題，另一方面可以延長細胞生長及表達目的蛋白時間[14]。范里等[15]采用兩階段動態(tài)流加培養(yǎng)方式大幅度延長細胞合成抗體融合蛋白的維持時間，提高生產(chǎn)效率。本研究室前期通過優(yōu)化溫度條件，確定了1.3節(jié)中流加培養(yǎng)方式并取得較好結(jié)果。因此，采用該流加培養(yǎng)方式進一步研究3種蛋白質(zhì)水解物對細胞生長及HSA/IL2表達的作用。以M1為對照組（Control組），5.0 g/L的 YE、Tyr、Soy為實驗組。 如圖 2（a）所示，Soy 組細胞密度及活率略高于Control組，培養(yǎng)時間為9 d；YE組、Tyr組細胞培養(yǎng)時間為11 d，YE組、Tyr組細胞密度和活率變化趨勢相近；第4天開始，YE組、Tyr組細胞密度高于 Control組、Soy 組；4~11 d，YE組、Tyr組細胞密度及活率持續(xù)高于Control組、Soy組。結(jié)果表明，含5.0 g/L YE或 Tyr的M1培養(yǎng)基，提高細胞密度及活率作用明顯，并且能夠延長細胞培養(yǎng)時間。

圖2 流加培養(yǎng)時不同水解物對細胞密度及HSA/IL2表達量影響Fig.2 Fed-batch culture using M1supplemented with 5 g/L of different hydrolasates

如圖 2（b）所示，與 Control組相比，YE 組 HSA/IL2表達量最高，其次為Tyr組；Soy組HSA/IL2表達量略高于Control組。以上結(jié)果表明：培養(yǎng)基M1中添加 3 種水解物（YE、Tyr、Soy）時，YE 提高細胞密度、活率和HSA/IL2表達量作用最明顯。

不同的蛋白質(zhì)水解物對細胞生長及產(chǎn)物作用差異顯著，趙麗麗等[16]將不同水解物進行混合，細胞生長密度和目的產(chǎn)物增加顯著。本研究中將3種水解物按一定比例混合后，細胞密度和HAS/IL2表達量未出現(xiàn)顯著提高。由此說明，優(yōu)化培養(yǎng)基時不僅需要篩選合適的添加組分，而且需要均衡營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 酵母提取物YE促進CHO細胞生長及HSA/IL2表達機理的初步探究

為了探究蛋白質(zhì)水解物YE促進CHO細胞生長和HSA/IL2表達的原因，對培養(yǎng)基滲透壓、YE中氨基酸種類、細胞周期、細胞凋亡等指標進行檢測。

2.3.1 滲透壓影響 研究報道[17-18]蛋白質(zhì)水解物的滲透壓、剪切力保護劑作用及抗凋亡的特性可改善細胞的生長狀況，因此對含不同水解物的培養(yǎng)基滲透壓進行檢測并分析（表2）。

表2 含不同水解物的培養(yǎng)基滲透壓值Table 2 Osmolalities of M1 medium supplemented with different hydrolysates

表2所示，添加3種蛋白質(zhì)水解物均增加M1培養(yǎng)基滲透壓；含YE的培養(yǎng)基滲透壓增加明顯，為341 mOsmol/kg，高出M1培養(yǎng)基25 mOsmol/kg。然而，Sung等[19]以NaCl為對照組，同等滲透壓時細胞表達蛋白產(chǎn)量增加，但促進細胞生長作用不明顯。由此推斷，添加YE雖然可以改變培養(yǎng)基的滲透壓環(huán)境，對HSA/IL2表達也有影響但非主要原因。

2.3.2 氨基酸影響 蛋白質(zhì)水解物含有豐富肽類物質(zhì)，其中氨基酸不僅用于細胞合成蛋白質(zhì)、核酸和酯類等物質(zhì)，同時也用于代謝產(chǎn)生能量。不同種類的水解物因來源不同，其氨基酸組成可能存在差異。本研究中利用高效液相分離技術(shù)，測定了3種蛋白質(zhì)水解物中游離氨基酸的種類和相對含量。結(jié)果表明：Tyr和Soy中氨基酸種類少，YE中氨基酸種類最多，除共有的幾種氨基酸外（L-Cys、L-Ile、LPhe），還包括相對含量較高的氨基酸有：L-Asp、LArg、L-Thr、L-Lys等。 相比 Tyr和 Soy，YE 含豐富氨基酸可能是其促進細胞生長及表達HSA/IL2作用最明顯的原因之一。Franek F等［17-18］認為蛋白水解物不僅為動物細胞生長提供氨基酸，還是特殊活性肽段的重要來源，這些肽段具有促進細胞增殖，提高細胞活力、增加產(chǎn)物表達等功能。YE中可能也存在某類活性肽段發(fā)揮重要作用，需要進一步的研究發(fā)現(xiàn)。

2.3.3 YE對細胞周期、細胞凋亡的影響 蛋白質(zhì)水解物會影響細胞周期分布，影響細胞增殖[20]。為了研究不同培養(yǎng)時期，YE對細胞周期分布的影響，選擇第2天（對數(shù)生長期）、第5天（表達期）的細胞做細胞周期分析，以M1培養(yǎng)的細胞為對照組，分別標記為Control-1、Control-2組；含5.0 g/L YE的M1培養(yǎng)細胞為實驗組（YE組），分別標記為YE-1、YE-2。

圖3 YE對不同時期細胞的周期分布影響Fig.3 Effects of YE on cell cycle in different periods

表3 YE作用下細胞周期分布情況Table 3 Phases of cell cycle with YE

如表 3所示：Control-1、YE-12組細胞 G1期比例無明顯差異，分別為46.55%和47.4%，但YE-1組細胞S期比例明顯高于Control-1組，由Control-1組的20.48%提高至30.33%。此結(jié)果表明，細胞對數(shù)生長期時，5.0 g/L YE可以提高細胞S期比例而幾乎不影響細胞G1期比例，利于細胞生長；在YE組中，YE-2細胞G1期比例明顯高于Control-2組，由Control-2組的58.12%提高至76.16%。此結(jié)果表明，細胞表達期時，M1培養(yǎng)基含5.0 g/L的YE時可以明顯提高細胞G1期比例而幾乎不影響細胞S期比例，延長細胞表達期時間，利于細胞表達HSA/IL2。

隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，細胞凋亡或壞死比例隨之增高。蛋白質(zhì)水解物可以抑制細胞凋亡的現(xiàn)象[21]。為了探究YE對細胞凋亡的影響，選擇第5天細胞，以M1培養(yǎng)的細胞為對照組（Control），含5.0 g/L YE的M1培養(yǎng)細胞為實驗組（YE組）。

圖4為YE對細胞凋亡影響圖，如圖所示，Control組細胞凋亡率為19.17%，YE組細胞凋亡率為13.18%，比Control組降低了5.99%。此外，YE組正常細胞比率（Q4）明顯高于Control組，由79.65提高至86.0%，與圖2（a）中細胞高活率結(jié)果一致。結(jié)果表明，M1培養(yǎng)基含5.0 g/L的YE時不僅可以提高細胞活率，而且可以降低細胞凋亡率，延長細胞培養(yǎng)時間。

圖4 YE對細胞凋亡的影響Fig.4 Effects of YE on cell apoptosis

3 結(jié)語

許多研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水解物可以促進哺乳動物細胞生產(chǎn)單克隆抗體、重組蛋白等生物制品[11]，降低細胞培養(yǎng)的成本，利于動物細胞工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加適宜質(zhì)量濃度的蛋白質(zhì)水解物在動物細胞培養(yǎng)、抗體及單克隆抗體生產(chǎn)、疫苗制備等生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文中研究了 3 種水解物 （Tyr、Soy、YE）對CHO細胞密度、細胞活率、目的蛋白HSA/IL2表達、細胞周期及細胞凋亡的影響。結(jié)果表明：（1）M1培養(yǎng)基中含不同質(zhì)量濃度（1.0、2.5、5.0、10.0 g/L）的蛋白質(zhì)水解物時，5.0 g/L 蛋白水解物（YE、Soy、Tyr）促進細胞生長及表達HSA/IL2作用明顯；（2）在3種水解物（YE、Soy、Tyr）中，5.0 g/L 的 YE 提高細胞密度、活率及表達HSA/IL2作用最明顯；（3）YE促進細胞生長及HSA/IL2表達作用明顯的原因可能是它含有豐富的氨基酸種類，并且可以提高培養(yǎng)基滲透壓；（4）細胞生長期時，YE可以提高細胞S期比例而有利于細胞生長；細胞表達期時，YE可以提高細胞G1期比例而有利于細胞表達HSA/IL2；（5）YE不僅可以提高細胞活率，而且可以降低細胞凋亡率，延長細胞培養(yǎng)時間。本研究為蛋白質(zhì)水解物在培養(yǎng)基優(yōu)化中的應(yīng)用提供了參考。