聚乙烯醇雙酶降解工藝條件優(yōu)化

趙一凡 ， 劉 松 ， 李江華 *， 堵國成 ， 陳 堅

（1.江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫214122）

聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，簡稱 PVA）是一種主要以1，3-二醇鍵的化學結構存在的、人工合成的高分子化合物，一般無味且呈粉末狀。由于PVA具有許多優(yōu)良特性，如乳化性、成膜性、高粘度、熱穩(wěn)定性等，被廣泛應用于紡織、造紙等行業(yè)[1-5]。PVA作為紡織工業(yè)中織物上漿的漿料，能夠使織物不易發(fā)生腐蝕和化學變化，同時可以增強織物的韌性。但為了加強棉織物對水的吸收[6]，經過上漿工藝的織物在成品前必須經過退漿處理以去除PVA。此外，退漿廢水中的PVA亦對環(huán)境造成嚴重的污染[7]。因此，開發(fā)PVA高效降解技術成為研究熱點。

目前PVA的降解方法主要包括：物理法、化學法和生物法[8]。物理法有泡沫分離、超濾、光催化、微波輻射等技術。盡管這些技術會產生一定的處理效果，但它們操作起來較復雜，投資費用和運行費用都較高，因此工業(yè)化應用難度較大[8]?；瘜W法是采用酸、堿或氧化劑在高溫條件下破壞PVA的長鏈結構使其降解，但易對棉纖維造成較大損傷，且能耗高。PVA是為數(shù)不多的生物可降解的水溶性材料[9]，采用生物方法降解PVA具有運行費用低、二次污染少等優(yōu)點，具有良好的發(fā)展前景。

PVA生物降解包括微生物法和酶法[3]。目前，研究者們得到的可以降解PVA的微生物包括單菌[10-12]、共生菌[13-15]和混合菌[16-17]。一般情況下，對于0.1%~0.5%質量分數(shù)的PVA，大多數(shù)細菌將其降解90%以上需要3~12 d[9]，降解速率較低。就PVA的降解過程而言，其本質上是酶的作用。主要有以下3種已報道的 PVA 降解酶：PVA 氧化酶（SAO，EC1.1.3.30）、PVA 脫氫酶 （PVADH，EC1.1.99.23）和氧化型PVA水解酶 （OPH，EC3.7.1.7）。生物降解PVA過程如下（圖1）。第一步：PVA在SAO（以 O2作為電子受體）或PVADH（以 PQQ作為電子受體）的作用下，脫氫氧化生成對應的酮基化合物；第二步：酮基化合物被 OPH水解[18]。其中，對SAO的研究還沒有深入到基因水平[19]，只停留在野生酶的純化和性質研究等方面。

在前期工作中，研究室實現(xiàn)了Sphingopyxissp.113P3 PVADH基因[20]和OPH基因[21]的異源高效表達。在此基礎上，研究對PVADH和OPH雙酶降解PVA的工藝條件進行了優(yōu)化，實現(xiàn)PVA酶法高效降解。

圖1 推測的PVA降解途徑Fig.1 Conjectural PVA degradation pathways

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 PVA脫氫酶 （PVADH）產生菌P.pastorisGS115/pPIC9K/tPVADH[20]及氧化型PVA水解酶（OPH）產生菌E.coliBL21（DE3）/pET20b（+）/soph[21]為本實驗室構建所得。

1.1.2 培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母提取物 10 g/L；

YPD固體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物 10 g/L，瓊脂 20 g/L；

BMGY液體培養(yǎng)基：甘油10 g/L，蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 pH 6.0，生物素 4×10-3g/L；

BMMY液體培養(yǎng)基：蛋白胨 20 g/L，酵母粉 10 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L 磷酸鉀緩沖液 pH 6.0，生物素 4×10-3g/L，甲醇體積分數(shù)1%；

LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L；

固體LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L；

TB培養(yǎng)基：酵母粉 24 g/L，蛋白胨 12 g/L，磷酸二氫鉀2.3 g/L，磷酸氫二鉀12.5 g/L，甘油 5 g/L。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將P.pastorisGS115/pPIC9K/tPVADH活化培養(yǎng)后，以體積分數(shù)3%的接種量接入BMGY培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min轉速下進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)24 h后收集菌體并重懸到BMMY培養(yǎng)基中，以體積分數(shù)1%甲醇為唯一碳源，于28℃、200 r/min轉速下進行誘導表達。甲醇每24 h補加體積分數(shù)1%，在上述條件下誘導120 h。

將重組菌E.coliBL21（DE3）/pET20b（+）/soph接種在LB培養(yǎng)基（含100 μg/mL氨芐青霉素）中，于37℃、200 r/min轉速下進行種子發(fā)酵。在培養(yǎng)12 h后菌液的OD600達到 4.5~5，以體積分數(shù)3%的接種量接種入 TB培養(yǎng)基 （含100 μg/mL氨芐青霉素），進行誘導，于25℃、200 r/min轉速下恒溫發(fā)酵108 h。

1.2.2 響應面實驗設計 根據(jù)單因素實驗和爬坡實驗，選擇 PVADH 酶量（100~150 U/mL）、pH（7~8）、溫度（39~43℃）為自變量，PVA降解率為響應值，應用Design-Expert V 8.0.6軟件設計三因素三水平Box-Behnken試驗（表1）。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

自變量與響應變量之間的關系可由一個擬合的二階多項式方程描述[23]：

式中，R為PVA降解率（%）；A為PVADH酶量的編碼值；B為pH的編碼值；C為酶反應溫度的編碼值；β0為常數(shù)項系數(shù)；β1、β2、β3為線性系數(shù)；β11、β22、β33為二次項系數(shù)；β12、β13、β23為交互系數(shù)。

1.2.3 PVA濃度檢測方法 PVA濃度的測定（用改良的Finley法[22]）：在10 mL比色管中分別加入待測樣品400 μL，25 g/L的硼酸3 mL和0.1 mol/L I2-KI 0.3 mL，用去離子水定容到10 mL，混勻后放于室溫下避光靜置10 min，在690 nm處測定其吸光值。PVA降解率計算如下式（1）：

式（1）中，β為PVA降解率，α0為反應前的 PVA質量濃度（g/L），α1為反應后的 PVA 質量濃度（g/L）。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

為優(yōu)化PVA的降解條件，研究了PVADH酶量、OPH酶量、酶反應溫度、pH、Ca2+濃度和底物質量濃度對PVA降解率的影響。單因素實驗的初始條件為：PVADH 150 U/mL、OPH 10 U/mL、酶反應溫度37℃、pH 7、Ca2+濃度1 mmol/L、 底物PVA質量濃度 1 g/L，PQQ 濃度 6 μmol/L，反應 1 h。

初始條件下，研究PVADH酶量和OPH酶量對PVA降解的影響。結果顯示，PVADH酶量在0~200 U/mL的范圍時，PVA的降解率隨著PVADH酶量的增加而提高；進一步提高PVADH酶量，PVA降解率略有降低；故確定PVADH酶量為200 U/mL（圖2（a））。在0~8 U/mL的范圍內，PVA降解率隨著OPH酶量的增加而增加；當OPH酶量在8~14 U/mL的范圍時，降解率變化不顯著（圖2（b））。由于OPH催化的底物是PVADH的產物，OPH對降解率的影響依賴于PVADH的催化速率?；诖?，選擇OPH酶量為12 U/mL。

圖2 PVADH酶量、OPH酶量、酶反應溫度、pH、Ca2+濃度和底物質量濃度對PVA降解率的影響Fig.2 Effect of PVADH concentration，OPH concentration，enzymatic temperature，pH ，Ca2+concentration and substrate concentration on PVA degradation efficiency

如圖2（c）所示，當溫度升高至47℃時PVA降解率達到了最大值，更高的溫度可能使PVA降解率下降。由圖2（d）可知，PVA最適酶解pH 為9。Ca2+可以作為酶促反應的激活劑和穩(wěn)定劑，0～1 mmol/L的Ca2+提高了PVA的酶促降解率，進一步提高Ca2+使 PVA 降解率明顯下降（圖 2（e）），故最適 Ca2+濃度為1 mmol/L。在以上初始酶反應條件下，PVADH和OPH能有效降解1 g/L PVA，提高PVA質量濃度導致降解率下降（圖 2（f））。

2.2 爬坡實驗

基于以上單因素實驗，選擇PVADH酶量、pH、酶反應溫度3個影響顯著的因素進行最陡爬坡實驗，從表2來看，爬坡實驗第3組PVA降解率最高，因此響應面的中心點應該在其附近產生。故以第3組條件為后續(xù)實驗的中心點進行分析。

2.3 響應面優(yōu)化

通過爬坡實驗確定了Box-Behnken實驗的中心點為PVADH酶量 125 U/mL、pH 7.5、酶反應溫度41℃。根據(jù)中心點，Box-Behnken試驗設計及結果見表3。利用Design-Expert V 8.0.6軟件對表3的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，PVA降解率 （R）對PVADH 酶量（A）、pH（B）、酶反應溫度（C）的二次多項回歸方程為：

表2 爬坡實驗安排表Table 2 Design and results of path of steepest ascent experiment

對模型進行方差分析。由表4可得出，試驗設計模型P＜0.0001，即該模型具有高度的顯著性；模型中，單個因素中的B、C對PVA降解率的影響顯著，交互項AB對PVA降解率的影響較顯著，二次項A2、B2及C2對PVA降解率的影響顯著。由F值可知，單因素對PVA降解率的影響順序為B（pH）＞C（溫度）＞A（PVADH酶量）。模型的失擬概率僅為0.0711，說明擬合的回歸方程符合實際情況。相關系數(shù)R2=0.9841，校正系數(shù)RAdj=0.9638，即不能由此模型進行解釋的降解率總變異只有3.62%，這表明模型與實際情況擬和較好，可用此模型對PVA降解率進行分析和預測。

表3 Box-Behnken設計試驗方案及響應值Table 3 Box-Behnken design and the correspondingresults

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance results for response surface quadratic model

為更直觀地理解實驗因素對PVA降解率的影響，利用Design-Expert V 8.0.6軟件得到了二次方程的三維響應面圖，如圖3所示。呈馬鞍形或橢圓形的等高線表示參數(shù)與參數(shù)之間交互作用顯著，呈圓形的等高線則表示參數(shù)與參數(shù)之間交互作用不顯著。由此，交互項AB影響較顯著，AC、BC次之。

圖3PVADH酶量與pH、PVADH酶量與溫度及pH與溫度交互作用的響應面圖Fig.3 Response surface showing the effects of AB、AC and BC on PVA degradation efficiency

利用Design-Expert V 8.0.6軟件預測出雙酶酶法降解PVA的最佳降解工藝：PVADH 122.54 U/mL，pH 7.69，酶反應溫度40.77℃。在此條件下，PVA的降解率為34.15%。根據(jù)實際情況，對該預測的工藝條件進行修正：PVADH 123 U/mL，pH 7.7，酶解溫度41℃。在此條件下，獨立進行3次實驗，反應1 h，得到的PVA降解率的平均值為34.07%，與理論值相符，說明該工藝可靠。

2.4 PVA酶促降解機制分析

目前，大多數(shù)研究者大都采用自己篩選的菌種，不同的菌種涉及到的PVA降解酶組合也都不盡相同。一般認為PVA酶促降解經由PVADH脫氫得到酮基化合物 （氧化型PVA），OPH再將氧化型PVA水解為小分子。但也有學者認為氧化型PVA的結構并不穩(wěn)定，它的降解也可以自發(fā)進行[7]?；诖?，有必要對PVA酶促降解過程進一步驗證。結果分析顯示，PAVDH和OPH雙酶共同降解PVA 4 h后，PVA接近完全降解；而PVADH單獨降解PVA時，PVA質量濃度總體上在下降，但經過大約12 h，PVA才基本降解完全。上述結果表明，PVADH可以單獨降解PVA，但降解速率較慢，而OPH可以加速氧化型PVA這種不穩(wěn)定結構的進一步降解，從而提高降解速率。

圖4 降解效果對比Fig.4 Comparison of degradation effects

3 結 語

生物法是一種“綠色環(huán)?！钡奶幚砑夹g，它將微生物或PVA降解酶應用于紡織退漿工藝或下游的廢水處理中，具有對織物損傷小、排污少、廢水處理簡單、處理能耗低、對設備要求低等優(yōu)勢。本研究應用響應面法和多項式數(shù)學模型對PVADH和OPH雙酶降解PVA的工藝條件進行優(yōu)化。得到的優(yōu)化條件為：PVADH 123 U/mL，OPH 12 U/mL，pH 7.7，酶解溫度 41 ℃，Ca2+濃度 1 mmol/L，PQQ 濃度 6 μmol/L，反應1 h，對1 g/L PVA降解率的平均值為34.07%，與響應面的預測值（34.15%）基本一致。當酶解反應經過4 h，降解率達到了95%以上。大多數(shù)細菌將0.1%~0.5%質量分數(shù)的PVA降解90%以上，一般情況下需要3~12 d[9]，與微生物法相比該雙酶降解工藝可實現(xiàn)PVA的快速降解。研究結果為進一步酶法生物降解PVA的放大和應用奠定了基礎。

但該雙酶降解工藝需要外加微量PQQ，PVADH只有結合輔助因子PQQ才具有催化活性，而PQQ的添加提高了使用成本。因此為盡快實現(xiàn)酶法降解PVA的應用，提高酶法降解PVA的競爭力，今后應積極開展對可替代PQQ的廉價輔因子的研究以及對PQQ體外再生系統(tǒng)的探索。