微生物谷胺酰胺轉(zhuǎn)氨酶在蛋白質(zhì)修飾中的應(yīng)用

程孝中， 趙鑫銳， 洪皓飛， 楊 敏， 周志昉， 吳志猛*

（1.江南大學(xué) 教育部糖化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.亳州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽亳州 236800）

蛋白質(zhì)是生命中最重要的生物大分子，蛋白質(zhì)通過修飾，形成不同功能的蛋白質(zhì)，生物體內(nèi)修飾主要包括泛素化、磷酸化、乙酰化、糖基化、甲基化等[1]。酶參與的蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾是近年來發(fā)展起來的一類新的蛋白質(zhì)修飾方法。該法具有反應(yīng)條件溫和，通常在水溶液和中性的pH環(huán)境下反應(yīng)；催化的反應(yīng)具有高度的專一性，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的區(qū)域和位點(diǎn)專一性修飾等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。最近研究比較多的酶主要有甲酰甘氨酸生成酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶 （PPTase）、OGlcNAc糖基轉(zhuǎn)移酶、分選酶（Sortase）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（Transglutaminases）、脂肪酸轉(zhuǎn)移酶、生物素連接酶、硫辛酸連接酶、N-肉豆蔻酰基轉(zhuǎn)移酶等[2]。其中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶修飾可形成異肽鍵（isopeptide bond），修飾后的產(chǎn)物不容易被蛋白酶降解，而且這種修飾反應(yīng)和分選酶的可逆反應(yīng)不一樣，是一種單向不可逆反應(yīng)，有利于提高產(chǎn)率[3]。因此，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在蛋白質(zhì)修飾中被廣泛關(guān)注。

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶主要分成兩大類。動(dòng)物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase 2，TG2）主要參與內(nèi)吞作用、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附等生命活動(dòng)，它是一類依賴于鈣離子的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶[4-6]。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（Microbial transglutaminases，MTGase）首次從鏈霉菌（Streptomyces mobaraensis）中分離得到，在自然界中主要催化蛋白質(zhì)之間的共價(jià)連接，這種特別的功能長(zhǎng)期以來主要應(yīng)用于食品和紡織工業(yè)中的蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而改變?nèi)?、羊毛、皮革的特性[7]。作為一種易得、便于使用、不依賴鈣離子調(diào)節(jié)的MTGase，近年來被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾。

本文作者綜述了微生物來源谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾中的最新進(jìn)展，這些定點(diǎn)修飾包括抗體與小分子之間、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與聚合物之間、蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)體之間的定點(diǎn)偶聯(lián)以及短肽的自身環(huán)化。

1MTGase的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理

MTGase內(nèi)部的二級(jí)結(jié)構(gòu)是由8個(gè)β折疊組成，外部是11個(gè)α螺旋，分子呈盤狀并帶有一個(gè)裂縫，2個(gè)環(huán)組成裂縫左壁，1個(gè)環(huán)組成裂縫右壁，裂縫深度為 16 ?，催化活性基團(tuán) Cys64、Asp255和His274均位于分子裂縫底部[8]（圖1），催化反應(yīng)時(shí)，底物進(jìn)入裂縫與催化活性基團(tuán)結(jié)合。MTGase最初以酶原形式存在，N端螺旋結(jié)構(gòu)占據(jù)裂縫空間，阻止底物進(jìn)入裂縫參與反應(yīng)[9]，當(dāng)N端螺旋結(jié)構(gòu)被內(nèi)源性的金屬蛋白酶和氨肽酶切去后轉(zhuǎn)變?yōu)橛写呋钚缘腗TGase[10-11]。利用氨基酸突變技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Asp255和His274在催化底物時(shí)發(fā)揮主要作用[12]。

圖1MTGase晶體結(jié)構(gòu)Fig.1 Overall sturcture of microbial tranlglutaminase

MTGase催化蛋白質(zhì)肽鏈中谷胺酰胺γ-羧酰胺基（?；w）與各種酰基受體發(fā)生酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，在蛋白質(zhì)和多肽當(dāng)中，谷氨酰胺常作為?；w，賴氨酸作為?；荏w發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。催化反應(yīng)時(shí)，Cys64側(cè)鏈的S親核攻擊酰基供體谷氨酰胺側(cè)鏈基團(tuán)上的C原子（圖2中（a））；Asp255提供一個(gè)質(zhì)子給氧離子中間體并釋放出氨（圖2中（b）、（c）、（d）），Asp255 形成帶負(fù)電的活化基團(tuán)；然后酰基受體（例如賴氨酸側(cè)鏈）在空間上接近Asp255活化基團(tuán)被親核攻擊并釋放產(chǎn)物（圖 2 中（e）、（f））。 根據(jù)?；荏w的不同，催化反應(yīng)可以分為3類[13]：1）?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，伯胺作為?；荏w（圖 3（a））；2）谷氨酰胺和賴氨酸間的交聯(lián)反應(yīng)，此時(shí)賴氨酸作為?；荏w，這種反應(yīng)主要出現(xiàn)在蛋白片段或者多肽間的連接反應(yīng)（圖 3（b））；3）脫酰基作用，水作為?；荏w（圖 3（c））。

圖2MTGase催化機(jī)理Fig.2 Catalytic reaction mechanism of MTGase

圖3 MTGase催化的化學(xué)反應(yīng)Fig.3 Reactions catalyzed by microbial transglutaminase

MTGase對(duì)底物具有一定的特異選擇性。對(duì)于?；w谷氨酰胺來說，其附近的氨基酸對(duì)MTGase的活性有較大影響。Sugimura Y等[14]利用肽文庫展示技術(shù)研究MTGase最適底物肽發(fā)現(xiàn)：當(dāng)谷氨酰胺N端-3位與-2位分別是芳香族氨基酸和亮氨酸，谷氨酰胺C末端+1、+2位和+3位分別是精氨酸、脯氨酸和酪氨酸時(shí)，MTGase催化活性最高。在這種規(guī)律基礎(chǔ)之上，Oteng-Pai等[15]合成了一系列的五肽和七肽，研究與MTGase結(jié)合活性時(shí)發(fā)現(xiàn)：七肽底物 7M42 （Ac-YELQRPY-NH2）和 7M48 （Ac-WALQRPH-NH2）與MTGase親和力最大。另外，Lee[16]課題組利用mRNA展示技術(shù)篩選出了高親和力的五肽底物（RLQQP和RTQPA），這些Q-Tag常用于MTGase對(duì)蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾當(dāng)中（表1）。相對(duì)?；w谷氨酰胺，MTGase的?；荏w底物比較廣泛[17-18]，對(duì)于非天然的?；荏w而言，伯胺類底物要求伯氨基團(tuán)與臨近的功能基團(tuán)之間必須間隔4個(gè)以上無側(cè)鏈碳原子才能獲得較高的反應(yīng)活性；與伯胺相連的烷基鏈越長(zhǎng)，反應(yīng)活性越高；因此MTGase可以催化ω-氨基酸、精胺、腐胺、尸胺、羥胺和N，N-二甲基-1，4-苯二胺等非天然的?；荏w[17，19-20]。在天然的酰基受體中，也存在活性比較高的序列，Lee[21]課題組利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）篩選到一個(gè)活性比較高的賴氨酸識(shí)別序列 （K-Tag）KTKTN，這種五肽底物的活性高于傳統(tǒng)的6個(gè)賴氨酸標(biāo)簽（K6）。

表1 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶識(shí)別的Q/K-TagTable 1 Examples of Q/K-Tag Recognized by Microbial Transglutaminase

2MTGase在蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用

2.1 MTGase在抗體定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用

將小分子藥物連接到抗體上形成抗體偶聯(lián)藥物（Antibody Drug Conjugates，ADCs），能夠提高藥物治療效果、安全性和靶向性。隨著治療乳腺癌和淋巴瘤的抗體偶聯(lián)藥物Kadcyla和Adcetris的成功上市[28]，抗體偶聯(lián)藥物成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。和臨床上其他的ADCs一樣，Kadcyla和Adcetris都是由小分子藥物通過化學(xué)方法隨機(jī)偶聯(lián)至抗體的賴氨酸位點(diǎn)，平均每個(gè)抗體可以偶聯(lián)3-4個(gè)小分子藥物，形成的藥物復(fù)合物均一性較差[29]。這種不均一性給ADCs藥物的質(zhì)量控制，藥物穩(wěn)定性以及治療效果帶來不確定性。因此，發(fā)展ADCs藥物的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)十分必要。

利用MTGase連接藥物與蛋白質(zhì)，必須要求目標(biāo)蛋白質(zhì)要有活性的谷氨酰胺，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量比較大的蛋白質(zhì)，此類谷氨酰胺較多，例如IgG1（typical immunoglobulin Gamma1）大約有 60 個(gè)谷氨酰胺，Josten[30]將氨基修飾過的生物素衍生物（圖4（b）1）作為酰基受體偶聯(lián)至抗體上的谷氨酰胺，平均每個(gè)抗體只能連接一到兩個(gè)生物素，而且無法確認(rèn)這些生物素所連接的特定位點(diǎn)，這勢(shì)必影響連接效率和均一性。 由于抗體上不同位點(diǎn)的偶聯(lián)會(huì)影響ADCs藥物在體內(nèi)分布、降解、藥物穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)[31-32]，所以，Josten等人的修飾方式往往導(dǎo)致ADCs藥物相對(duì)狹窄的治療指數(shù)。Pavel[27]與他們的合作者則利用基因工程手段將單克隆抗體IgG1的重鏈C端帶上Q-Tag（LLQGG），可以將帶有氨基標(biāo)簽的熒光素（圖 4（b）2）、糖衍生物（圖 4（b）3）、螯合劑（圖 4（b）4，4（b）5）、微管蛋白抑制劑（圖 4（b）6）、熱休克蛋白90抑制劑、DNA損傷藥物連接到抗體上；另外，這種定點(diǎn)修飾可以發(fā)生在抗體的Fab和Fac結(jié)構(gòu)域，其中熒光基團(tuán)的偶聯(lián)效率可以達(dá)到79%。Q-Tag的定點(diǎn)引入極大地提高了ADCs與小分子藥物偶聯(lián)的均一性。

圖4 MTGase在抗體定點(diǎn)修飾中的應(yīng)用Fig.4 Application of MTG to antibody modification

除了將藥物利用MTGase偶聯(lián)到抗體上外，MTGase還可以將一些放射性核素偶聯(lián)至抗體，抗體與放射性核素的偶聯(lián)在放射影像學(xué)以及診斷學(xué)有重要作用。例如，對(duì)chCE7抗體進(jìn)行Ga標(biāo)記，可以追蹤抗體在生物體內(nèi)放射性分布；把抗體與Zr偶聯(lián)標(biāo)記可進(jìn)行X斷層掃描[33]。在對(duì)chCE7抗體進(jìn)行放射免疫偶聯(lián)時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)[27，33-36]，chCE7抗體297位的天冬酰胺由于糖基化導(dǎo)致295位的谷氨酰胺無法進(jìn)行偶聯(lián)，當(dāng)297位去糖基化后，295位的谷氨酰胺具有很好的偶聯(lián)活性；或者將297位突變成谷氨酰胺，297和295兩個(gè)位點(diǎn)都可以進(jìn)行偶聯(lián)。這是因?yàn)?97位的糖基化使得295位的谷氨酰胺位點(diǎn)由于空間位阻很難被MTGase所識(shí)別，如果去糖基化或者突變使得 295 位點(diǎn)暴露來[37]（圖 4（a）），反應(yīng)則可進(jìn)行。

2.2 MTGase在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)定點(diǎn)偶聯(lián)中的應(yīng)用

在食品工業(yè)中，MTGase可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)間的交聯(lián)，從而改變食品的風(fēng)味和蛋白質(zhì)（酶）的功能，這種蛋白質(zhì)交聯(lián)是隨機(jī)的、非定向的[38]。引入定向修飾可以改善修飾產(chǎn)物的均一性，這對(duì)于蛋白質(zhì)修飾來說至關(guān)重要，均一性的修飾產(chǎn)物表現(xiàn)出優(yōu)越的生物特性。為了克服這一問題，同樣利用基因工程手段，將蛋白質(zhì)或酶的活性中心之外的區(qū)域標(biāo)記上一個(gè)MTGase識(shí)別的谷氨酰胺或者賴氨酸位點(diǎn)，這樣人們可以將任何感興趣的修飾基團(tuán)添加到蛋白質(zhì)上，而且這種修飾是定點(diǎn)和特異性的（圖5）[23]。譬如，Nagamune等[39]通過基因工程手段在細(xì)胞色素P450中引入帶 Q或 K的短肽標(biāo)簽 （tag），利用MTGase成功將另外2個(gè)功能性蛋白偶聯(lián)到P450上，得到P450多功能酶；他們還將沒有MTGase識(shí)別位點(diǎn)的野生型綠色熒光蛋白通過基因工程引入MTGase識(shí)別位點(diǎn)，利用MTGase將綠色熒光蛋白（GFP）與待檢測(cè)蛋白核糖核酸酶S肽偶聯(lián)，應(yīng)用于蛋白質(zhì)檢測(cè)[40]；利用同樣的方法，可以將單結(jié)構(gòu)域抗體片段結(jié)合到堿性磷酸酶用于酶聯(lián)免疫測(cè)定[41]。另外，借助基因工程手段，MTGase還可以實(shí)現(xiàn)酶固定化，Goto 等[42]在堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AP）的N端利用基因工程手段表達(dá)一個(gè)可以提供賴氨酸位點(diǎn)的短肽MKHKGS，酪蛋白利用化學(xué)方法固定于聚丙烯樹脂，然后利用MTGase將堿性磷酸酶與樹脂固定化的酪蛋白連接，實(shí)現(xiàn)堿性磷酸酶的固定化。最后，利用這種方法還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的多聚化，Scheller[43]課題組將單結(jié)構(gòu)域的抗體接入核糖核酸酶S肽標(biāo)簽后可以和腫瘤壞死因子形成二聚體或多聚體，這種多聚體比單聚體活性更高。上述這種利用基因工程手段引入MTGase修飾位點(diǎn)的方法，其優(yōu)點(diǎn)是擴(kuò)大了被修飾蛋白質(zhì)的范圍。

圖5 MTGase通過基因工程引入識(shí)別標(biāo)簽介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的偶聯(lián)Fig.5 Protein ligation mediated by MTGase through genetically encoded tag

2.3 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與聚合物之間的定點(diǎn)偶聯(lián)

2.3.1 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與PEG （polyethyleneglycol）定點(diǎn)偶聯(lián) 聚乙二醇PEG通常用來修飾藥物蛋白質(zhì)和多肽，可以顯著改善這些藥物的體內(nèi)半衰期，提高藥物的穩(wěn)定性和活性。在PEG末端通過化學(xué)方法引入氨基，可以模擬賴氨酸側(cè)鏈氨基功能，然后利用MTGase實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的PEG化。Sato[44]于1996年首次利用豚鼠肝來源的谷胺酰轉(zhuǎn)氨酶實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的PEG修飾。之后，他們完善了這種修飾方法[45]，改用MTGase將人白介素-2單個(gè)活性位點(diǎn)Q74連接上12×103的PEG，同時(shí)PEG另一端引入半乳糖殘基 （Gal3），Gal3是肝細(xì)胞膜上去唾液酸糖蛋白受體 （asialoglycoprotein receptor ASGP-R）的配體，Gal3的引入賦予白介素-2靶向性，修飾后的藥物半衰期延長(zhǎng)，同時(shí)保持原有藥物活性不變。

另外，F(xiàn)ontana[46-47]課題組利用MTGase對(duì)肌紅蛋白和人生長(zhǎng)激素PEG修飾進(jìn)行了初步探索，但修飾后的藥物均一性較差，因此，他們?cè)噲D通過不同的方法改變這一缺陷。例如，人生長(zhǎng)激素（hGH）雖然有13個(gè)谷氨酰胺，Pasut等[48]研究發(fā)現(xiàn)，通過改變MTGase酶與底物的量，將PEG末端帶上氨基可以定點(diǎn)連接至蛋白質(zhì)的Q141位點(diǎn)，能夠得到均一性較好的偶聯(lián)體；另外還可以改變?nèi)軇┓磻?yīng)體系，Mero等[49]以鮭降鈣素（sCT）和人生長(zhǎng)激素作為模式蛋白，在MTGase反應(yīng)體系中添加不同比例的有機(jī)溶劑（DMSO，EtOH，MeOH，MeCN，TFE），在水/有機(jī)溶劑共溶劑系統(tǒng)中可以實(shí)現(xiàn)鮭降鈣素和人生長(zhǎng)激素的定點(diǎn)PEG修飾，這可能是因?yàn)槿軇└淖兞四康牡鞍缀兔傅亩?jí)結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的（圖6）[50]。

上述通過改變反應(yīng)物的量或者溶劑反應(yīng)體系策略雖然在一定程度能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定點(diǎn)PEG化，但仍然無法做到精確控制。蛋白質(zhì)上能夠被修飾的谷氨酰胺或者賴氨酸位點(diǎn)相對(duì)于總的谷氨酰胺或者賴氨酸位點(diǎn)是比較少的，在許多蛋白質(zhì)中這種能夠被識(shí)別的修飾位點(diǎn)就只有1個(gè)或者2個(gè)，如果能夠確定這些修飾位點(diǎn)就能夠?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)修飾而得到均一性的偶聯(lián)體。Maullu等[51-52]利用計(jì)算機(jī)信息學(xué)方法，通過理性設(shè)計(jì)，在人粒細(xì)胞集落刺激因子上找到定點(diǎn)修飾位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了定向位點(diǎn)引入PEG。

圖6 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)定點(diǎn)PEG修飾Fig.6 MTGase-mediated site-specific protein PEGlation

2.3.2 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與POZ（polyoxazoline）之間的定點(diǎn)偶聯(lián) 雖然PEG修飾藥物已經(jīng)商品化并成為蛋白質(zhì)藥物修飾的金標(biāo)準(zhǔn)，但PEG具有諸如免疫反應(yīng)、難清除等缺點(diǎn)，人們?cè)噲D找到性能更好的多聚體修飾物。惡唑啉多聚體（POZ）是最近幾年發(fā)現(xiàn)的另外一種水溶性、生物相容性優(yōu)良的多聚體。在合成惡唑啉多聚體時(shí)，通過化學(xué)方法在終止末端引入功能性基團(tuán)氨基，該惡唑啉多聚體能被MTGase識(shí)別并與人粒細(xì)胞集落刺激因子上的Q殘基連接，形成蛋白-惡唑啉多聚體復(fù)合物[53]。這些復(fù)合物無論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，與修飾前相比較，都表現(xiàn)出較高的生物活性。

2.4 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之間的定點(diǎn)偶聯(lián)

利用MTGase，還可以將寡聚糖偶聯(lián)至一些食品類蛋白質(zhì)上，一般是將葡萄糖胺作為酰胺基供體接至酪蛋白[54]、谷蛋白水解物上[55]，從而改變這些蛋白質(zhì)的特性，例如，利用殼寡糖對(duì)大豆蛋白進(jìn)行糖基化，修飾后的大豆蛋白疏水性和乳化作用較低，乳劑穩(wěn)定性提高，對(duì)水和油的結(jié)合能力提高[56]。

在修飾工業(yè)酶方面，Villalonga等[57-59]利用MTGase對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行了環(huán)糊精 （CD）、葡聚糖（DEX）、羧甲基纖維素（CMC）、聚蔗糖（FIC）等糖基化修飾，修飾后的胰蛋白酶在熱穩(wěn)定性、酶活性等方面均有改善；將氨基化葡聚糖通過MTGase偶聯(lián)的方法同樣應(yīng)用于過氧化氫酶的修飾[60]，相對(duì)于化學(xué)修飾，這種酶法修飾能夠顯著提高酶的活性，但是，由于每個(gè)過氧化氫酶偶聯(lián)的葡聚糖數(shù)量較少，導(dǎo)致總體相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)于PEG修飾后的相對(duì)分子質(zhì)量較低，與PEG修飾后的過氧化氫酶比較，葡聚糖修飾后的過氧化氫酶的血清半衰期較短。

對(duì)藥用蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾的報(bào)道較少，藥用蛋白質(zhì)的糖基化可以提高藥用蛋白質(zhì)的半衰期以及生物利用度，例如，Ramos等[61]首先探索了利用MTGase化學(xué)酶法合成神經(jīng)糖肽的可行性，在此基礎(chǔ)上，Sato等[62]利用MTGase在胰島素上實(shí)現(xiàn)了糖基化修飾，發(fā)現(xiàn)野生型胰島素的Q很難進(jìn)入MTGase活性中心，導(dǎo)致偶聯(lián)效果不佳，他們將胰島素B鏈的N端氨基酸F突變?yōu)镼，然后利用MTGase 引入乳糖（圖 7），最后利用 α-2，6-siaT（a-2，6-sialyltransferase，唾液酸轉(zhuǎn)移酶）引入唾液酸。由于細(xì)菌以及癌細(xì)胞表面糖型結(jié)構(gòu)與正常哺乳動(dòng)物細(xì)胞是不一樣的，而且大多數(shù)細(xì)胞表面受體的配體含有糖基化結(jié)構(gòu)[63-65]，因此，基于MTGase的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)還有望在糖疫苗研發(fā)、藥用蛋白的靶向性方面發(fā)揮重要作用。

羥乙基淀粉（HES）由于具有水溶性較好，易于代謝，較好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，逐漸用來替代PEG修飾蛋白質(zhì)和多肽藥物。Besheer[66-67]課題組首次利用MTGase對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行HES修飾，HES首先引入cbz-QG和己二胺（HMDA），這樣HES既可以作為酰基供體也可以作為?；荏w，再利用MTGase與酪蛋白偶聯(lián)，形成HES修飾蛋白。

圖7 MTGase介導(dǎo)的胰島素定點(diǎn)糖基化修飾Fig.7 MTGase mediated site-specific insulin modification by oligosaccharides

2.5 其他應(yīng)用

MTGase可用于環(huán)肽的合成，傳統(tǒng)環(huán)肽的合成是將線性肽首尾（或者側(cè)鏈基團(tuán)之間）化學(xué)連接，為了避免其他側(cè)鏈基團(tuán)的副反應(yīng)，要求側(cè)鏈基團(tuán)全保護(hù)，酶法合成環(huán)肽避免了這一缺陷。Touati等[68]以MTGase底物WALQRPH為出發(fā)點(diǎn)，在C端接入GGG連接臂和酰基受體K（H-WALQRPHGGGKSNH2），實(shí)驗(yàn)證明Q的N端-1，-2位的氨基酸對(duì)環(huán)肽形成至關(guān)重要，但是可以任意改變Q的C端序列。另外，他們以血管舒緩素PK15為例，證明了MTGase合成雙環(huán)肽的可能性。

圖8 MTGase介導(dǎo)的蛋白質(zhì)定點(diǎn)脂質(zhì)化修飾Fig.8 MTG mediated site-specific protein modification by lipid

最后，MTGase可用于蛋白質(zhì)的脂質(zhì)化修飾。Abe等[69]通過基因工程在綠色熒光蛋白（EGFP）的C端接入 K-Tag（MRHKGS）（圖 8（b）），通過化學(xué)方法合成了不同長(zhǎng)度的脂肪酸鏈修飾的七肽序列GGGSLLQG（圖 8（a））提供?；w。雖然野生型EGFP有多個(gè)賴氨酸和谷氨酰胺殘基，但實(shí)驗(yàn)證明該蛋白質(zhì)并不能被MTGase所識(shí)別[40]；相反，C-端帶有K-Tag的EGFP能順利被MTGase識(shí)別，并與帶有?；w的脂肪鏈反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白的定點(diǎn)脂質(zhì)化修飾。

3 結(jié)語

自從日本味之素公司首次從鏈霉菌屬中分離到谷胺酰胺轉(zhuǎn)氨酶以來，因其底物的寬泛性，廣泛應(yīng)用于食品類蛋白質(zhì)的交聯(lián)。近年來，通過基因工程手段在蛋白質(zhì)的適當(dāng)位置引入MTGase能夠識(shí)別的Q-Tag或K-Tag，利用化學(xué)和酶法相結(jié)合等手段，MTGase介導(dǎo)的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為蛋白質(zhì)定點(diǎn)修飾的一個(gè)有效手段。特別是在抗體藥物制備方面的應(yīng)用，在提高藥用蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性、半衰期等方面都取得了很好的進(jìn)展。另外，這種修飾方法還可以用于對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)追蹤目的蛋白、生物醫(yī)學(xué)造影等。但由于蛋白質(zhì)上能夠被修飾谷氨酰胺或者賴氨酸位點(diǎn)較少，該法不能應(yīng)用于所有蛋白質(zhì)，其普適性還有待進(jìn)一步提高。同時(shí)，該法定點(diǎn)修飾蛋白質(zhì)的效率還需要進(jìn)一步提高，因此，利用酶工程手段改造MTGase，進(jìn)一步提高其催化效率也是以后研究的重點(diǎn)。綜上所述，基于MTGase的酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)已經(jīng)發(fā)展為一種高效的、高選擇性的蛋白質(zhì)連接和修飾方法，該方法在蛋白質(zhì)藥物研究中會(huì)發(fā)揮重要作用。