補(bǔ)陽還五湯對腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植后神經(jīng)功能的保護(hù)作用

吳 增，董賢慧，周曉紅，靳曉飛，高維娟

(1．河北中醫(yī)學(xué)院河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050200；2. 承德醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000)

缺血性腦血管疾病是危害人類健康最常見的疾病之一，具有發(fā)病率高、致死率高、致殘率高等特點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細(xì)胞，可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這一生理特性為神經(jīng)再生和修復(fù)提供了理論上的依據(jù)。但內(nèi)源性NSCs數(shù)量少，遠(yuǎn)不能滿足神經(jīng)功能修復(fù)的需要。研究表明，外源性NSCs移植可以促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)[1-2]，并通過抑制神經(jīng)凋亡蛋白的表達(dá)來減輕神經(jīng)損傷[3]。補(bǔ)陽還五湯是治療腦中風(fēng)偏癱的名方，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)之效，現(xiàn)代用于治療缺血性腦病、中風(fēng)后遺癥、冠心病等。研究表明，在腦缺血后，補(bǔ)陽還五湯可以促進(jìn)內(nèi)源性NSCs的分化[4]，降低神經(jīng)元的凋亡率[5]。雖然補(bǔ)陽還五湯與NSCs移植對缺血性腦損傷均有確切的療效，但補(bǔ)陽還五湯是否能夠促進(jìn)NSCs移植后腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)？是否可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)？相關(guān)方面的報(bào)導(dǎo)甚少。因此，本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)陽還五湯與NSCs移植相結(jié)合，探討其對腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥物補(bǔ)陽還五湯，由河北中醫(yī)學(xué)院門診部提供，組方參考《方劑學(xué)》[6]：生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g。將藥物加蒸餾水浸泡2 h，一煎加蒸餾水500 mL，煎至150 mL；二煎加水300 mL，煎至100 mL，將兩煎混合后濃縮至100 mL(1 mL約含1.43 g生藥)。于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD孕鼠10只；SPF級(jí)SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量(290±10) g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011。

1.3 試劑DMEM/F-12(1 ∶1)、B-27、Accutase酶，購于Gibco公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)，購于PeproTech公司；兔抗大鼠巢蛋白(nestin)多克隆抗體，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；甲苯胺藍(lán)染液，購于北京索萊寶科技有限公司；2、3、5，氯化三苯基四氮唑(TTC)染色劑，購于Biosharp公司；抗Bax、Bcl-2抗體，購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DM5000B型光學(xué)顯微鏡、EG11508型組織包埋機(jī)、RM2255型全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica公司)；IX73型生物顯微鏡(OLYMPUS公司)；H2050R型離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；51700型全自動(dòng)腦立體定位儀(美國Stoelting)。

2 方法

2.1 NSCs提取、培養(yǎng)、鑒定[7]采用由DMEM/F12(97%)、B27(2%)、青鏈霉素(1%)、EGF(20 μg·L-1)、bFGF(20 μg·L-1)配制成的培養(yǎng)基。取孕14 d的SD大鼠，麻醉后，置于75%酒精中浸泡30 min，取出子宮，置于75%酒精中浸泡2 min，在超凈臺(tái)內(nèi)取出胎鼠大腦皮質(zhì)，置于含有D-Hank’s液的平皿中，分離并去除腦膜，將腦組織轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基的平皿中，用眼科剪剪碎，收集入離心管，吹打至無可見組織塊，離心后去上清，加入培養(yǎng)基，吹打均勻后過細(xì)胞篩。接種后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d加液1.5 mL，每6～7 d傳代1次，傳代時(shí)用Accutase酶將神經(jīng)球消化成單細(xì)胞，加入培養(yǎng)基終止消化，離心后去上清，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取培養(yǎng)至第5代的NSCs進(jìn)行nestin免疫熒光染色，鑒定細(xì)胞。

2.2 動(dòng)物模型的制備采用改良線栓法建立大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型，方法如下：將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，術(shù)前禁食12 h、不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，固定大鼠，備皮，碘伏消毒，在頸部正中做2 cm切口，鈍性分離肌肉，解剖出左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)。血管夾夾閉CCA和ICA，在ECA上靠近動(dòng)脈分叉處與遠(yuǎn)離動(dòng)脈分叉處，各結(jié)扎1根手術(shù)縫合線，靠近分叉處縫合線打結(jié)但不系死，用顯微剪于兩根手術(shù)線之間剪一斜口，將線栓經(jīng)斜口插至頸動(dòng)脈分叉處，將靠近分叉處縫合線系死，在兩根縫合線之間離斷ECA，松開血管夾，調(diào)整線栓插入方向與ICA一致，用眼科鑷輕輕將線栓送入ICA，插入深度由分叉處算起(18±1)mm。缺血2 h后，拔出線栓，將ECA殘端系死，碘伏消毒，縫合傷口。術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，按Zea Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走困難，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，喪失意識(shí)；5分，動(dòng)物死亡。1、2、3分為模型成功，列為實(shí)驗(yàn)對象。

2.3 分組與給藥將60只SD大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、移植組、補(bǔ)陽還五湯+移植組。假手術(shù)組線栓由ECA插入ICA約5 mm即可，其余各組造模方法相同。采用灌胃給藥的方式，補(bǔ)陽還五湯組與補(bǔ)陽還五湯+移植組于MCAO模型麻醉清醒后給藥，劑量為14.8 g·kg-1·d-1，每日分兩次給予，其余各組給予等體積的蒸餾水。各組大鼠于造模術(shù)后d 14進(jìn)行指標(biāo)檢測。

2.4 NSCs移植對培養(yǎng)至第5代6～7 d的NSCs進(jìn)行傳代，將神經(jīng)球消化成單細(xì)胞，以1 000 r·min-1離心10 min，去上清，加入無菌生理鹽水，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×1011·L-1備用。移植組與補(bǔ)陽還五湯+移植組在大鼠MCAO模型制備成功24 h后，重新麻醉，固定于腦立體定位儀上，頭頂部皮膚備皮消毒，正中矢狀位做2 cm切口，暴露前囟，微量注射器吸入備好的NSCs懸液10 μL，將微量注射器固定于腦立體定位儀上，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，定位并鉆孔，將NSCs懸液緩慢注射到左側(cè)紋狀體區(qū)(AP=0.36 mm，ML=3.15 mm，DV=5.5 mm)7 μL，注射到左側(cè)大腦皮質(zhì)(AP=0.36 mm，ML=3.15 mm，DV=2.0 mm)3 μL，注射速度為1 μL·min-1，注射完畢后留針10 min，緩慢拔出注射器，骨蠟封閉針孔，碘伏消毒，縫合皮膚。其余各組注射等體積無菌生理鹽水。

2.5 TTC染色檢測大鼠腦梗死體積大鼠斷頭取腦，迅速取出大腦置于腦切片磨具中，-80 ℃冰箱內(nèi)冷凍5 min，從前至后對大腦行冠狀位切片，共切5片，每片厚度為2 mm，置于由PBS配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的TTC染液中，37 ℃避光恒溫孵育30 min，每隔15 min翻動(dòng)1次。將腦組織切片置于4%多聚甲醛中固定4 h后拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析大腦梗死體積。

2.6 腦組織固定與切片將大鼠麻醉后固定于操作臺(tái)，于胸腔正中迅速剪開皮膚、肌肉與肋骨，暴露心臟，于心尖處剪口，插入灌流針至主動(dòng)脈處并固定，于右心房處剪一小口，先灌注50 mL預(yù)冷的生理鹽水，再灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛50 mL，迅速斷頭取腦，將腦組織浸泡于4%多聚甲醛中24 h。以AP=0.36 mm為起始面，對腦組織由前至后行2 mm厚冠狀位切片，然后進(jìn)行組織脫水、透明、浸蠟和包埋。用全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)做厚度為3 μm的冠狀位石蠟切片。

2.7 尼氏染色觀察缺血半暗帶細(xì)胞形態(tài)并分析尼氏體累積光密度值將石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，將切片放入0.5%甲苯胺藍(lán)染液中染色5 min，蒸餾水洗，1%的冰醋酸稍分化，蒸餾水洗終止反應(yīng)，顯微鏡下控制分化程度，蒸餾水洗后，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析尼氏體累積光密度值。

2.8 免疫組織化學(xué)染色法檢測缺血半暗帶Bcl-2與Bax的表達(dá)將石蠟切片脫蠟至水，然后置于檸檬酸修復(fù)液中，于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，切片放入3%雙氧水溶液中，室溫避光孵育25 min，山羊血清封閉液覆蓋組織，室溫封閉30 min，甩掉封閉液，在切片上滴加由PBS配制的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育50 min，滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色，蘇木精復(fù)染3 min，自來水沖洗，蘇木精分化液分化數(shù)秒，自來水沖洗，蘇木精返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗，梯度乙醇、二甲苯脫水透明，切片稍晾干后，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對相同的棕黃色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 NSCs培養(yǎng)及鑒定結(jié)果如Fig 1所示，第5代神經(jīng)球生長狀態(tài)良好。nestin免疫熒光染色呈陽性(Fig 2)。

Fig 1 Neurospheres in good state (×400)

3.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的變化如Fig 3所示，大鼠造模術(shù)后14 d，假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損。與假手術(shù)組相比，模型組神經(jīng)功能缺損評分增高(P<0.05)；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組、移植組、補(bǔ)陽還五湯+移植組神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)；與移植組相比，補(bǔ)陽還五湯+移植組神經(jīng)功能缺損評分降低，差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 2 Positive pictures of 5th neurospheres nestin immunofluorescent staining (×400)A: The nestin protein of neurospheres labeled with Cy3; B: DAPI to redye the nucleus of NSCs; C: Merged A and B.

Fig 3 Statistical analysis of nerve function defect score of rats in each group n=6)

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel;▲P<0.05vstransplant

3.3 各組大鼠腦梗死體積的變化如Fig 4所示，假手術(shù)組未見梗死灶。與假手術(shù)組相比，模型組腦梗死明顯(P<0.05)；與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組、移植組、補(bǔ)陽還五湯+移植組腦梗死體積明顯縮小(P<0.05)；與移植組相比，補(bǔ)陽還五湯+移植組腦梗死體積縮小，差異具有顯著性(P<0.05)。

3.4 各組大鼠神經(jīng)元形態(tài)學(xué)與尼氏體累積光密度值的變化如Fig 5所示，假手術(shù)組細(xì)胞數(shù)量較多，輪廓清晰，尼氏體豐富，細(xì)胞排列規(guī)則。與假手術(shù)相比，模型組細(xì)胞較少，輪廓模糊不清，尼氏體明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，尼氏體累積光密度值明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組、移植組、補(bǔ)陽還五湯+移植組細(xì)胞狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，輪廓較清晰，尼氏體增多，尼氏體累積光密度值明顯增加(P<0.05)。與移植組相比，補(bǔ)陽還五湯+移植組尼氏體累積光密度值增加，差異具有顯著性(P<0.05)。

3.5 各組大鼠腦組織中Bcl-2/Bax表達(dá)的變化如Fig 6所示，假手術(shù)組大鼠腦組織中僅有少量Bcl-2和Bax表達(dá)，與假手術(shù)組相比，模型組Bcl-2與Bax表達(dá)增加，Bcl-2/Bax明顯下降(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯組、移植組、補(bǔ)陽還五湯+移植組Bcl-2表達(dá)增加，Bax表達(dá)減少，Bcl-2/Bax明顯升高(P<0.05)。與移植組相比，補(bǔ)陽還五湯+移植組Bcl-2表達(dá)增加，Bcl-2/Bax升高，差異具有顯著性(P<0.05)。

4 討論

對于腦血管疾病的治療，目前臨床上主要采用超早期溶栓、腦神經(jīng)保護(hù)和恢復(fù)期的神經(jīng)康復(fù)等措施，雖然部分患者神經(jīng)功能恢復(fù)較好，但仍有一大部分患者遺留癱瘓、失語等嚴(yán)重疾患。因此，如何積極有效地促進(jìn)腦缺血/再灌注損傷后恢復(fù)期神經(jīng)功能的恢復(fù)，仍是目前研究的重點(diǎn)。近年來，隨著體外培養(yǎng)NSCs技術(shù)的不斷成熟，外源性NSCs移植已用于多種神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病的治療。NSCs移植治療腦缺血/再灌注損傷的機(jī)制可能包括以下幾個(gè)方面：①NSCs可以分化為神經(jīng)元，替代受損的神經(jīng)元而發(fā)揮生理作用；②抑制神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)元損傷[8]；③NSCs可以產(chǎn)生許多生長因子，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)；④激活損傷區(qū)神經(jīng)元的自我修復(fù)功能；⑤促進(jìn)缺血區(qū)微血管再生，改善局部微循環(huán)障礙[9]。

Fig 4 Cerebral infarct volume examined by TTC staining of rats in each group n=6)

#P<0.05vssham;*P<0.05vsmodel;▲P<0.05vstransplant

腦缺血/再灌注損傷屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，清代醫(yī)家王清任提出“中風(fēng)”乃系機(jī)體“元?dú)馓潛p，經(jīng)絡(luò)空虛，氣向一側(cè)歸并而呈半身不遂”，并創(chuàng)立了補(bǔ)陽還五湯。中風(fēng)恢復(fù)期以氣虛血瘀證候最為常見，氣行則血行，氣虛則血液運(yùn)行不暢，脈絡(luò)瘀阻，筋脈失養(yǎng)而發(fā)為偏枯，本證氣虛為本，血瘀為標(biāo)。補(bǔ)陽還五湯具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，益氣活血恰合病機(jī)。本方以黃芪為君藥，補(bǔ)氣以行血；當(dāng)歸尾活血通絡(luò)而不傷血，用為臣藥；桃仁、赤芍、紅花、川芎協(xié)同當(dāng)歸尾活血祛瘀；地龍通經(jīng)活絡(luò)，周行全身，以行藥力，諸藥合用，則氣旺、淤消、絡(luò)通，諸癥向愈。腦缺血/再灌注損傷的發(fā)病與興奮性氨基酸毒性作用、腦組織能量衰竭、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)異常等機(jī)制相關(guān)[10]?，F(xiàn)代研究認(rèn)為，補(bǔ)陽還五湯可以在許多方面發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，如抑制細(xì)胞凋亡[11]、改善微循環(huán)障礙[12]、抑制血小板活化[13]、抗氧化[14]、調(diào)節(jié)腦組織能量代謝[15]等。細(xì)胞凋亡是在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由嚴(yán)格和復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控而發(fā)生的細(xì)胞自主性程序性的死亡過程。凋亡蛋白Bcl-2與Bax的比率反映了細(xì)胞凋亡的程度，比值越高，凋亡程度越輕，細(xì)胞存活率越高。

Fig 5 Nissl staining in brain tissue of rats in each group (×400)

Fig 6 Expression of Bcl-2 and Bax of brain tissue of
rats in each group(×400)

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯組與移植組較模型組神經(jīng)功能缺損程度減輕，腦梗死體積縮小，尼氏體累積光密度值增高，Bcl-2/Bax增高，而補(bǔ)陽還五湯+移植組神經(jīng)修復(fù)作用更為明顯。據(jù)此推測，補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合NSCs移植可能通過抑制腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。有研究表明，NSCs可以在神經(jīng)損傷區(qū)存活和遷移，從而上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，來抑制損傷區(qū)神經(jīng)元凋亡[16]。補(bǔ)陽還五湯也可以促進(jìn)NSCs移植后的增殖和遷移[17]，促進(jìn)體外培養(yǎng)的NSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。由此我們設(shè)想，補(bǔ)陽還五湯有可能對移植后NSCs增殖、分化及遷移起到促進(jìn)作用，從而進(jìn)一步抑制神經(jīng)元凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可以對NSCs移植后腦缺血/再灌注大鼠神經(jīng)元凋亡起到抑制作用，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。為了更好地發(fā)揮補(bǔ)陽還五湯與NSCs治療缺血性腦損傷的協(xié)同作用，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將探討補(bǔ)陽還五湯是否對移植后的NSCs增殖、分化及遷移有促進(jìn)作用。