基于 1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)探討黨參不同炮制品對(duì)免疫抑制大鼠的影響

郝艷艷，聶春霞，何 盼，武曉偉，劉 聰，郝旭亮

(1. 山西省中醫(yī)藥研究院中藥方劑研究所，山西 太原 030045；2. 山西省中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西 太原 030619)

黨參是桔梗科植物Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.川黨參CodonopsistangshenOliv.和素花黨參CodonopsispilosulaNannf var.modesta(Nannf.)L. T. Shen的干燥根[1]。具補(bǔ)中益氣、健脾益肺的作用，是中醫(yī)常用補(bǔ)氣藥。作為補(bǔ)益類中藥材，黨參在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)方面的研究廣泛而深入。張曉君等[2]發(fā)現(xiàn)，黨參多糖對(duì)體液免疫有較強(qiáng)促進(jìn)作用。張雅君等[3]的研究也發(fā)現(xiàn)，黨參粗多糖提取液可促進(jìn)小鼠脾臟B淋巴細(xì)胞的增殖，提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，進(jìn)而調(diào)整機(jī)體免疫功能。

歷代中醫(yī)家對(duì)黨參炮制也較為重視，通過(guò)輔料或不同炮制方法讓黨參的功效也各有不同。如米炒后的黨參健脾的作用增強(qiáng)，蜜炙后的黨參益氣作用增強(qiáng)[4]，酒炙和蜜炙可升高黨參的多糖含量，米炒、麩炒可使黨參多糖含量降低[5]。楊中林等[6]研究黨參不同炮制品時(shí)發(fā)現(xiàn)：在提高小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力方面，蜜炙黨參優(yōu)于米炒黨參和生黨參，初步證明臨床補(bǔ)氣用傳統(tǒng)的蜜炙法炮制品為佳。本文利用代謝組學(xué)技術(shù)，旨在進(jìn)一步明確黨參不同炮制品對(duì)環(huán)磷酰胺(cylophosphamide，CTX)所致免疫抑制大鼠的影響，并深入研究其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑黨參飲片(批號(hào)：20180104)、米炒黨參飲片(批號(hào)：20180110)、蜜炙黨參飲片(批號(hào)：20180101)，由山西振東集團(tuán)提供，均為潞黨參及其炮制品。氯化鈉注射液(杭州民生藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；CTX(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：18022125)；IL-2 ELISA試劑盒、免疫球蛋白G(IgG)ELISA試劑盒、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)ADL公司；氘代重水(D2O)，購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司。

1.2 儀器KDC-2046高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；HEMAVET 950FS全自動(dòng)血液分析儀(美國(guó)Drew Scientific公司)；貝克曼流式細(xì)胞儀Cytomics FC 500(COULTER TQ-Prep工作站)；Synergy H1酶標(biāo)儀(BioTek公司)；Bruker AVANCE III 600超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker公司)。

1.3 樣品制備黨參及其各炮制品飲片60 ℃烘干，加8倍水煎煮3次，每次1 h，過(guò)濾，濾液濃縮至一定濃度，60 ℃常壓烘干，備用。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及給藥50只SPF級(jí)SD大鼠，♀♂各半，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為5組，每組10只，♀♂各半，即空白對(duì)照組(NS)、模型組(MS)、黨參藥材(Cp，3.75 g·kg-1生藥)、蜜炙黨參(HCp，3.75 g·kg-1生藥)、米炒黨參(RCp，3.75 g·kg-1生藥)。各給藥組按每只大鼠10 mL·kg-1劑量灌胃相應(yīng)藥物，空白對(duì)照組及模型組給予等體積生理鹽水；連續(xù)14 d，每天1次。給藥d 1起，除空白對(duì)照組外，各組均腹腔注射CTX(40 mg·kg-1·d-1)，連續(xù)3 d，同時(shí)治療給藥。實(shí)驗(yàn)前禁食(不禁水)12 h。最后1 d給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，一部分血置于抗凝管中；剩余血液置于EP管中，靜置1 h左右，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，分裝，-20 ℃冰箱保存，備用。摘取十二指腸、空腸和回腸(各約3 cm)置于平皿中，縱行剖開(kāi)，刮取腸黏膜黏液，收集于同一離心管。內(nèi)容物與生理鹽水按1 ∶1(W/V)稀釋，混勻后，3 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，取上清液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 指標(biāo)檢測(cè)部分外周血用動(dòng)物血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)外周血細(xì)胞；剩余部分外周血用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群CD4+、CD8+表達(dá)。采用ELISA法，分別檢測(cè)血清中IL-2、IgG的含量，ELISA法檢測(cè)腸道sIgA含量。

2.3 核磁樣品制備與測(cè)試將400 μL解凍的血清加入311 μL D2O，渦旋30 s，4 ℃、13 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液600 μL于5 mm核磁管中進(jìn)行核磁測(cè)試。采用Bruker 600 MHz AVANCE Ⅲ NMR譜儀采集數(shù)據(jù)，CPMG序列壓制水峰，掃描次數(shù)為64，譜寬12 345.7 Hz，圖譜大小65 536數(shù)據(jù)點(diǎn)，脈沖寬度(PW)=30°(12.7 us)，傅里葉變換LB=0.3 Hz，延遲時(shí)間為5.0 s。

2.41H NMR圖譜處理與分析采用MestReNova核磁圖譜處理軟件(version 8.0.1)對(duì)所有1H NMR圖譜進(jìn)行手動(dòng)相位和基線調(diào)整。所有圖譜以肌酸(δ 3.04)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行化學(xué)位移、相位與基線校正，對(duì)δ 0.60～9.00區(qū)域的譜圖進(jìn)行0.01等寬度分割積分，切除水峰δ 4.50～5.00。剩余積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化后，運(yùn)用SIMCA-P 13.0(Umetrics，瑞典)軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。主成分分析(principal component analysis，PCA)反映的是樣本內(nèi)部固有的差異性和相似性，以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)，進(jìn)一步進(jìn)行偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal PLS-DA，OPLS-DA)，用排列實(shí)驗(yàn)(permutation tests，200次)來(lái)驗(yàn)證PLS-DA的有效性。結(jié)合OPLS-DA的VIP值和相應(yīng)的s-plot圖，尋找組間的差異代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 免疫細(xì)胞結(jié)果Tab 1結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組白細(xì)胞總數(shù)、B淋巴細(xì)胞數(shù)及T細(xì)胞常數(shù)，結(jié)合BMRB(Biological Magnetic Resonance Data Bank, http://www.bmrb.wisc.edu/)數(shù)據(jù)庫(kù)，以及文獻(xiàn)[7-9]中數(shù)據(jù)對(duì)圖譜進(jìn)行指認(rèn)，在大鼠血清中共指認(rèn)出32種代謝產(chǎn)物，包含大量的氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸等，結(jié)果見(jiàn)Tab 3(Fig 1中標(biāo)號(hào)與Tab 3相對(duì)應(yīng))。

Fig 1 Typical 1H NMR spectrum of serum from rats

Tab 1 Effect of Codonopsis pilosula and its differentprocessed products on counts of

**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

CD4+/CD8+值明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明免疫低下模型復(fù)制成功；給藥后，黨參組(P<0.01)、蜜炙組(P<0.01)和米炒組(P<0.05)均有明顯升高，說(shuō)明3組炮制品均可明顯提高機(jī)體免疫細(xì)胞水平。

3.2 免疫因子結(jié)果Tab 2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組各免疫因子含量明顯降低(P<0.01)；給藥后，黨參組(P<0.05)、米炒黨參組(P<0.01)、蜜炙黨參組(P<0.01)對(duì)IL-2均有明顯回調(diào)作用；黨參組對(duì)IgG有升高作用(P<0.01)，米炒黨參組和蜜炙黨參組則沒(méi)有變化；對(duì)于sIgA，只有蜜炙組對(duì)其有回調(diào)作用(P<0.05)，米炒組和黨參組沒(méi)有變化。

3.3 黨參不同炮制品對(duì)免疫抑制大鼠血清的代謝組學(xué)結(jié)果

3.3.1血清1H NMR圖譜的指認(rèn)與分析 大鼠血清的核磁圖譜見(jiàn)Fig 1。根據(jù)化學(xué)位移、峰形、偶合為了進(jìn)一步分析模型組與空白組之間的差異，首先采用PCA散點(diǎn)圖(Fig 3A)觀察兩組樣本的分離趨勢(shì)，可以看出模型組與空白組明顯分離；進(jìn)一步采用PLS-DA分析(Fig 3B)，并在PLS-DA模型成立的基礎(chǔ)上，對(duì)原始數(shù)據(jù)建立排列實(shí)驗(yàn)，表明隨機(jī)變量Y變量產(chǎn)生的R2、Q2均小于原始值(Fig 3C，R2=纈氨酸、醋酸、葡萄糖、丙酮酸含量降低；異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰0.995，Q2=0.875)，證明模型有效可靠。通過(guò)S-plot(Fig 3D)結(jié)合VIP值，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(P<0.05)尋找差異代謝物，得到14個(gè)具有顯著性差異的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。與空白對(duì)照組相比，模型組中糖蛋白、O-乙酰糖蛋白、甘油磷酰膽堿(GPC)、鯊肌醇含量升高。所有差異代謝物在各組中的含量分布見(jiàn)Fig 4，結(jié)果表明，蜜炙黨參組基本對(duì)所有差異代謝物均有明顯回調(diào)作用，黨參組和米炒黨參組對(duì)個(gè)別代謝物有明顯回調(diào)作用。

Tab 2 Effects of different processed products of

*P<0.05,**P<0.01vsNS;#P<0.05,##P<0.01vsMS

3.3.2多元統(tǒng)計(jì)分析 由于NMR圖譜反映的信息較多，很難直觀地反映出各組之間的差異，因此借助多元統(tǒng)計(jì)分析做進(jìn)一步的分析。采用PCA 3D散點(diǎn)圖對(duì)所有樣本進(jìn)行分析, 以顯示數(shù)據(jù)的原始分類狀態(tài)(Fig 2)，可以看出對(duì)照組與模型組明顯分離，表明模型復(fù)制成功；黨參組在三維空間里更接近于模型組，而蜜炙黨參組和米炒組與模型組明顯分開(kāi)，說(shuō)明蜜炙黨參組和米炒組與模型組差異較大；其中蜜炙黨參組與模型組相距最遠(yuǎn)，提示蜜炙黨參組具有明顯回調(diào)作用。

Tab 3 1H NMR assignments of major metabolites from serum of rats

PC: Phosphatidylcholine; GPC: Glycerophosphocholine; TMAO: Trimethylamine oxide; m: multiple peaks; s: single peak; d: double peaks; t: triple peaks; J: coupling constant.

Fig 2 PCA 3D score plot of rat serum among all groups

3.3.3代謝通路分析 將找到的差異代謝物輸入www.metaboanalyst.cn進(jìn)行Met PA分析，將Pathway Impact>0.1的代謝途徑列為最重要的代謝途徑，得到與免疫低下模型相關(guān)的代謝通路如Fig 5所示。

Fig 3 PCA score plot(A),PLS-DA score plot(B),correspondingvalidation(C),and S-plot(D) from serum of rat between control and model groups

4 討論

4.1 免疫細(xì)胞結(jié)果分析白細(xì)胞是體內(nèi)防御系統(tǒng)的重要組成部分，其數(shù)量的減少代表著機(jī)體免疫功能低下[10]。B淋巴細(xì)胞是體液和細(xì)胞免疫的重要組成部分，能夠通過(guò)多種調(diào)控方式發(fā)揮正向免疫調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞在免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮中樞的作用，CD4+T細(xì)胞具有輔助細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答的作用，CD8+T細(xì)胞則是重要的效應(yīng)細(xì)胞，兩者的比值可以反映機(jī)體免疫功能水平。給藥后，黨參組及各炮制品組均可明顯升高模型大鼠白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及T細(xì)胞CD4+/CD8+值水平。與米炒黨參相比，黨參組和蜜炙黨參組在改善CTX引起的白細(xì)胞及淋巴細(xì)胞數(shù)減少方面效果更好。各給藥組在提高T細(xì)胞CD4+/CD8+值方面效果相當(dāng)。

4.2 免疫因子結(jié)果分析sIgA是構(gòu)成腸道黏膜免疫的重要組成成分，也是維持其穩(wěn)態(tài)的第一道防線。IL-2是重要的免疫調(diào)控因子，可直接增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能，能促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及抗體形成[11]等。IL-2也可直接活化B細(xì)胞，使其生長(zhǎng)并刺激抗體產(chǎn)生，故也是一種B細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫[12]。IgG是免疫系統(tǒng)重要的組成部分，其含量一定程度上反映了機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱。給藥后，黨參可明顯提高IL-2、IgG水平；蜜炙黨參明顯改善免疫抑制引起的IL-2、sIgG含量降低；米炒黨參升高模型大鼠IgG水平明顯。

4.3 代謝通路分析亮氨酸、異亮氨酸，是蛋白質(zhì)和葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)器[13]，也是維持淋巴細(xì)胞敏感性與免疫細(xì)胞功能所必需的功能物質(zhì)。纈氨酸屬生糖氨基酸，可促進(jìn)糖異生，還能通過(guò)影響免疫球蛋白的合成來(lái)影響免疫功能[14]。本實(shí)驗(yàn)中，米炒組、蜜炙組纈氨酸含量升高，說(shuō)明給予其可促進(jìn)機(jī)體葡萄糖的生成，產(chǎn)生更多能量，同時(shí)合成免疫球蛋白，提高機(jī)體免疫力；蜜炙黨參組亮氨酸、異亮氨酸含量降低，說(shuō)明蜜炙組促進(jìn)其代謝，維持機(jī)體各免疫細(xì)胞的功能，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力。

谷氨酸、谷氨酰胺是淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等快速分裂的主要能源物質(zhì)，在其代謝過(guò)程中起氮的載體和供體作用，可間接提高白細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的增殖，改善機(jī)體免疫作用[15]。給藥后，谷氨酸、谷氨酰胺含量降低，推測(cè)谷氨酸、谷氨酰胺不斷快速代謝，從而加速淋巴細(xì)胞增殖，提高機(jī)體免疫力，這一變化與免疫細(xì)胞結(jié)果相一致。

丙氨酸和谷氨酸是體內(nèi)重要氨基酸，通過(guò)氨基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化。丙氨酸是肝臟合成葡萄糖的主要底物，影響白細(xì)胞的合成，進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能。有研究表明，在B淋巴細(xì)胞雜交瘤中添加2 mmol·L-1的丙氨酸可以防止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)以及刺激抗體的產(chǎn)生[16]。模型組大鼠血清丙氨酸及谷氨酸含量升高，表明CTX引起機(jī)體丙氨酸和谷氨酸的蓄積，利用率明顯降低，從而造成免疫抑制。黨參各炮制品治療后，丙氨酸和谷氨酸水平均有向?qū)φ战M回調(diào)的趨勢(shì)，其中以蜜炙黨參組效果最明顯，表明黨參可以促進(jìn)丙氨酸和谷氨酸的代謝，從而修復(fù)機(jī)體免疫功能缺陷。

葡萄糖、丙酮酸是糖代謝中重要能源物質(zhì)，機(jī)體進(jìn)行有氧代謝時(shí)，葡萄糖生成丙酮酸后，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，保證機(jī)體正常供能。本實(shí)驗(yàn)中，蜜炙黨參組葡萄糖和丙酮酸含量高于模型組，說(shuō)明免疫低下模型大鼠的糖代謝以無(wú)氧代謝為主，而黨參組以有氧代謝為主，從而提高機(jī)體供能水平。

Fig 5 MetPA analysis of metabolic pathway

1:Valine, leucine, isoleucine metabolism; 2: Glutamate, glutamine metabolism; 3: Alanine, asparticacid, glutamicate metabolism.

GPC參與細(xì)胞膜對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，屬脂質(zhì)代謝的中間體。本實(shí)驗(yàn)中，蜜炙黨參組GPC含量降低，說(shuō)明蜜炙黨參可以改善CTX誘導(dǎo)的細(xì)胞膜的損傷，維持免疫細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。

乙酰糖蛋白作為炎癥反應(yīng)的急性期反應(yīng)蛋白[17]，在機(jī)體受到刺激發(fā)生炎癥反應(yīng)后含量升高[18]。本研究中，蜜炙黨參組O-乙酰糖蛋白、N-乙酰糖蛋白含量低于模型組，表明CTX誘導(dǎo)免疫低下大鼠的炎癥反應(yīng)發(fā)生，蜜炙黨參可促使機(jī)體免疫反應(yīng)恢復(fù)，免疫力趨于正常。

本研究基于1H NMR代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)比了黨參及其不同炮制品(米炒黨參、蜜炙黨參)對(duì)免疫抑制大鼠的影響。結(jié)果表明，對(duì)于CTX所致的免疫低下大鼠，蜜炙黨參改善效果優(yōu)于黨參和米炒黨參，表現(xiàn)在明顯提高大鼠血清中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+值、IL-2、sIgA的含量，明顯回調(diào)血清中12個(gè)內(nèi)源性代謝物的水平，主要通過(guò)纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸代謝，谷氨酸、谷氨酰胺代謝以及丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝3條通路，以及其他物質(zhì)(如葡萄糖、丙酮酸、GPC以及乙酰糖蛋白)的代謝來(lái)發(fā)揮免疫作用。該研究結(jié)果為黨參藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其不同炮制品的臨床精準(zhǔn)化使用提供了理論依據(jù)。