結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)在肺結(jié)核快速診斷中的應(yīng)用價值

李桂杭 高東花 黃振超 羅世戰(zhàn) 翟翀 王輝

[摘要]目的 研究結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（Xpert MTB/RIF）在肺結(jié)核快速診斷中的應(yīng)用。方法 選取2018年1～12月我院收治的132例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象，所有疑似患者分別采用液體分枝桿菌培養(yǎng)管（MGIT）培養(yǎng)法和Xpert MTB/RIF檢測法。比較兩種檢測方法的靈敏度和特異性。結(jié)果 132例患者中，經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診為肺結(jié)核的患者120例，非肺結(jié)核患者12例。液體MGIT培養(yǎng)法檢查確診為肺結(jié)核的患者89例，陰性43例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結(jié)核的患者106例，陰性26例。Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養(yǎng)法的66.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養(yǎng)法的25.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 對于疑似肺結(jié)核的患者，可采取Xpert MTB/RIF檢測法，臨床診斷價值較高，且靈敏度和特異性較高，患者可及時治療，改善其預(yù)后，值得臨床采納。

[關(guān)鍵詞]液體分枝桿菌培養(yǎng)管;實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù);肺結(jié)核;快速診斷

[中圖分類號] R521? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（c）-0149-03

[Abstract] Objective To study the application of real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection of Mycobacterium tuberculosis/Rifampicin resistance （Xpert MTB/RIF） in rapid diagnosis of tuberculosis. Methods A total of 132 suspected tuberculosis patients admitted to our hospital from January to December 2018 were selected as the research objects， all suspected tuberculosis patients were cultured by liquid mycobacterium culture tube （MGIT） and detected by Xpert MTB/RIF. The sensitivity and specificity of the two methods were compared. Results Among 132 patients， 120 were diagnosed as tuberculosis by gold standard， and 12 were non-tuberculosis. 89 cases were diagnosed as tuberculosis by liquid MGIT culture， 43 cases were negative. Xpert MTB/RIF test was performed in 106 patients with confirmed pulmonary tuberculosis and 26 patients with negative pulmonary tuberculosis. The sensitivity of Xpert MTB/RIF assay was 87.50%， higher than 66.67% of liquid MGIT culture method， the difference was significant （P<0.05）. The specificity of Xpert MTB/RIF assay was 91.67%， which was significantly higher than 25.00% of liquid MGIT culture method， the difference was significant （P<0.05）. Conclusion Xpert MTB/RIF can be used to detect suspected pulmonary tuberculosis patients. It has high clinical diagnostic value， high sensitivity and specificity. Patients can be treated in time to improve their prognosis， which is worthy of clinical adoption.

[Key words] Mycobacterial growth indicator tube; Real-time fluorescence quantitative nucleic acid amplification detection; Pulmonary tuberculosis; Rapid diagnosis

肺結(jié)核屬于慢性傳染性疾病，住院時間長，大多患者為貧困人群，采取快速可靠的方式進行診斷、實施精準(zhǔn)治療對于控制結(jié)核病具有重要意義[1-5]。本研究旨在探討液體分枝桿菌培養(yǎng)管（MGIT）培養(yǎng)法和結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（Xpert MTB/RIF）在肺結(jié)核快速診斷中的應(yīng)用價值，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2018年1～12月我院收治的132例疑似肺結(jié)核患者作為研究對象，其中，女54例，男78例;年齡16～80歲，平均（44.87±5.34）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①疑似肺結(jié)核患者需要具有肺結(jié)核明顯的臨床癥狀與體征;②出現(xiàn)乏力、咯血、午后低熱等明顯癥狀的患者;③均知曉本研究且愿意參加者;④本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①影像學(xué)檢查不典型者;②病例檢查或支氣管鏡檢查為肺結(jié)核感染者;③出現(xiàn)心腦、肝腎等器官疾病者;④臨床資料不完善者。

1.2方法

分別在晨間、晚間、即時3個時間段取1次患者痰液，按照臨床實驗室檢驗規(guī)程，進行涂片染色與質(zhì)量監(jiān)控操作。3個時間段取痰所制標(biāo)本，任意1次的檢出結(jié)果為陽性，記為結(jié)核分枝桿菌檢出陽性。藥敏實驗使用菌液均取自液體MGIT培養(yǎng)法檢出陽性者[6]。

液體MGIT培養(yǎng)法：本院的結(jié)核桿菌液體培養(yǎng)采用BD公司BACTECMGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀（美國JOHNSTON實驗公司）及其配套試劑（包括MGIT培養(yǎng)管、MGITOADC營養(yǎng)添加劑、PAN-TA雜菌抑制劑）。取1 ml痰標(biāo)本置于50 ml有蓋的尖底離心管中，取N-乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉前處理液消化20 min，再次加入磷酸鹽緩沖液（PBS）到50 ml，3000 r/min離心15 min，棄上清，利用pH值為6.8的PBS液，將剩余沉淀制備成0.5 ml懸濁液，將其接種在MGIT培養(yǎng)管中。接種前，將MGIT培養(yǎng)管在無菌條件下分別加入0.8 ml MGITPANTA/OADC混合液備用。將MGIT培養(yǎng)管置入BACTECMGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀孵育培養(yǎng)。儀器自動判定培養(yǎng)結(jié)果，陰性培養(yǎng)管培養(yǎng)判讀持續(xù)6周。檢出結(jié)果為陽性的培養(yǎng)管，進行涂片抗酸染色以確定是否為分枝桿菌;檢出結(jié)果為陰性的培養(yǎng)管在仔細觀察管內(nèi)渾濁情況。取0.1 ml液體MGIT培養(yǎng)法培養(yǎng)的陽性菌液，用生理鹽水稀釋100倍。取2支MGIT培養(yǎng)管，標(biāo)為對照管與研究管，分別加入0.8 ml營養(yǎng)添加劑。將100 μl利福平加入觀察管中，加入0.5 ml陽性菌液;對照管加入0.5 ml∶100稀釋后的陽性菌液。置入BACTECMGIT 960全自動分枝桿菌快速培養(yǎng)鑒定藥敏儀內(nèi)進行培養(yǎng)，儀器根據(jù)分枝桿菌的生長情況對比而判斷該藥物敏感性。

Xpert MTB/RIF檢測法：取1 ml痰標(biāo)本置于帶蓋前處理管，加入2 ml SR痰標(biāo)本處理液，將前處理管旋緊，置于螺旋振蕩器上震蕩20～30 s，取下靜置15 min，確保痰標(biāo)本能夠充分液化[7]。取2 ml處理后的痰標(biāo)本經(jīng)過加樣孔加入Gene Xpert反應(yīng)盒內(nèi)，將反應(yīng)盒置于Gene Xpert檢測模塊中，使用儀器自動檢測，檢測結(jié)果需要在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察。將液體MGIT培養(yǎng)法檢出陽性的痰標(biāo)本，使用上述方法檢測MTB對利福平的耐藥情況。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩種檢測方法的靈敏度及特異度。靈敏度=真陽性/（真陽性+假陰性）×100%;特異性=真陰性/（真陰性+假陽性）×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1液體MGIT培養(yǎng)法檢查的診斷效能分析

132例患者中，經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診為肺結(jié)核的患者120例，非肺結(jié)核患者12例。液體MGIT培養(yǎng)法檢查確診為肺結(jié)核的患者89例，陰性43例（表1）。

2.2 Xpert MTB/RIF檢測法檢查的診斷效能分析

132例患者中，經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診為肺結(jié)核的患者120例，非肺結(jié)核患者12例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結(jié)核的患者106例，陰性26例（表2）。

2.3兩種檢測方法靈敏度與特異性的比較

Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養(yǎng)法的66.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養(yǎng)法的25.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

3討論

隨著我國人口流動處于較為頻繁的狀態(tài)，且我國外來肺結(jié)核患者的流動性較大，耐藥結(jié)核病、結(jié)核菌/艾滋病病毒雙重感染、流動人口結(jié)核病防治屬于今后結(jié)核病防治工作的三大挑戰(zhàn)，應(yīng)根據(jù)實際逐步開展結(jié)核菌培養(yǎng)與藥物敏感性實驗，確?；颊吣艿玫郊皶r的診斷[8-12]。

本研究結(jié)果顯示，132例患者中，經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)確診為肺結(jié)核的患者120例，非肺結(jié)核患者12例。液體MGIT培養(yǎng)法檢查確診為肺結(jié)核的患者89例，陰性43例。Xpert MTB/RIF檢測法檢查確診為肺結(jié)核的患者106例，陰性26例。Xpert MTB/RIF檢測法的靈敏度為87.50%，高于液體MGIT培養(yǎng)法的66.67%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;Xpert MTB/RIF檢測法的特異性為91.67%，明顯高于液體MGIT培養(yǎng)法的25.00%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)是將樣品準(zhǔn)確、定量PCR擴增與熒光檢測結(jié)合的檢測分析系統(tǒng)，操作較為簡單，且無需培訓(xùn)，僅需要在標(biāo)本盒中加入待檢測標(biāo)本，系統(tǒng)即可自動完成標(biāo)本純化，24 h內(nèi)可獲得檢測結(jié)果[13-14]。檢測期間封閉性較好，不會出現(xiàn)交叉感染，對涂陰肺結(jié)核患者敏感度較高，目前該項技術(shù)已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織納為結(jié)核病推薦的檢驗方法[15]。而MGIT培養(yǎng)法檢測原理主要為底部包埋的熒光物質(zhì)，能夠?qū)ε囵B(yǎng)管中的氧含量變化產(chǎn)生一定的反應(yīng)，結(jié)核分枝桿菌在MGIT內(nèi)生長會消耗管內(nèi)氧，受到特定光源激發(fā)后，熒光物質(zhì)會釋放出熒光，并采取讀數(shù)儀進行判定;整個操作較為復(fù)雜，耗時較長。且Xpert MTB/RIF能夠多通道設(shè)計，可同時檢測多個標(biāo)本，檢測時間明顯縮短，臨床較為高效，并提供利福平耐藥基因突變信息，為肺結(jié)核的快速診斷提供了重要參考。

綜上所述，對于疑似肺結(jié)核的患者，可采取Xpert MTB/RIF進行檢測，診斷價值較高，能確保患者及時進行治療，改善其預(yù)后，值得應(yīng)用。由于本研究樣本數(shù)量有限，研究項目較少，結(jié)果可能會出現(xiàn)一定的偏差，臨床后期可加大樣本容量，增加研究項目，完善實驗結(jié)果。

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（收稿日期：2019-03-08? 本文編輯：劉克明）