竹醋液殼聚糖復(fù)合涂膜對椪柑保鮮效果的研究

陳 藝，黎 琴，吳亞倩，劉 紅，胡尚連，趙 博

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽621010）

椪柑（Citrus reticulata cv.Ponkan）是我國主要的柑橘類水果之一，果實皮薄易剝、色澤鮮美、組織緊密、濃甜脆嫩，深受大眾喜愛。椪柑果實在采后容易受青霉病、綠霉病等真菌性病害的侵染而腐爛變質(zhì)，難以貯藏。目前國內(nèi)主要利用化學(xué)保鮮劑來對椪柑進行防腐保鮮［1］。但長期使用化學(xué)保鮮劑，不但會使微生物產(chǎn)生抗藥性而導(dǎo)致保鮮效果下降，而且污染環(huán)境，嚴重影響人們的身體健康。因此，尋求安全、無毒、高效的天然產(chǎn)物保鮮劑成為新的研究熱點［2］。

殼聚糖又名脫乙酰甲殼素，是幾丁質(zhì)的脫乙酰衍生物［3］，具有良好的成膜性。殼聚糖由于含有游離氨基［4］，與微生物細胞膜表面帶負電的物質(zhì)相互作用，可使細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)發(fā)生泄漏死亡。此外殼聚糖能在微生物表面形成致密的膜，阻止微生物的呼吸及營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運［5］，對細菌、真菌等微生物具有抑制作用，從而可以降低果實貯藏期間的腐爛率［6-7］，有效提高果實的保鮮效果［8-10］。竹醋液是竹材在熱解或干餾的過程中產(chǎn)生的煙氣經(jīng)冷凝得到的具有多種化學(xué)成分的棕褐色液體［11］，帶有天然熏香味。它含有200多種有機成分以及數(shù)10種礦物質(zhì)，主要成分為水、有機酸、酚類、酮類、醇類［12］，是一種純天然、綠色環(huán)保的新產(chǎn)品。研究表明：竹醋液有良好的抑菌效果［13］，如對大腸桿菌［14］、金黃色葡萄球菌［15］、蘋果炭疽病病菌［16］有較好的抑制作用，是一種很有潛力的天然果蔬保鮮劑。

根據(jù)實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，雖然殼聚糖和竹醋液均有一定的抑菌效果，但是各自的能夠抑制的微生物范圍相對較窄，單獨作為果蔬保鮮劑使用效果較差。鑒于此，研究將對柑橘類果實危害最大的綠霉病病原菌-指狀青霉（Penicillium digitatum）作為對象菌，研究殼聚糖和竹醋液各自的抑菌效力，并將二者復(fù)配成復(fù)合保鮮劑，研究其對椪柑果實的保鮮效果，以期為椪柑的貯藏保鮮提供一條新的途徑，同時為竹醋液這種竹加工產(chǎn)物提供一條有效的利用途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：恒溫培養(yǎng)振蕩箱（金壇市精達儀器制造有限公司）；超速離心機（Eppendorf公司）；電導(dǎo)率儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；恒溫水浴鍋（常州智博瑞儀器制造有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；紫外分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；高壓滅菌鍋（三洋電機株式會社）；紅外線二氧化碳分析儀（北京華云分析儀器有限公司）；手持折光儀（浙江力辰儀器科技有限公司）。

試劑與樣品：竹醋液（浙江義烏寶泰家居用品有限公司）；殼聚糖（山東匯益生物科技有限公司）；指狀青霉病菌（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心）；2，6-二氯酚靛酚鈉鹽、PVPP、PVP、聚乙二醇6000（PEG6000）、聚乙二醇單辛基苯基醚（TritonX-100）、鄰苯二甲酸氫鉀、硫代巴比妥酸、無水醋酸鈉、愈創(chuàng)木酚（阿拉丁試劑）；98%濃硫酸、冰醋酸、氫氧化鈉、草酸、酚酞、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、碳酸氫鈉、亞硫酸鈉、30%過氧化氫溶液、乙醇（國藥集團化學(xué)試劑成都有限公司）。

試驗材料：椪柑采摘于學(xué)校附近一管理良好的果園，當(dāng)日運回西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院實驗室。挑選果形均勻，無病蟲害、成熟度一致的椪柑果實于室溫預(yù)貯2 d后進行保鮮處理。

1.2 方法

1.2.1 指狀青霉菌菌種的活化 在無菌環(huán)境下，用接種環(huán)挑取指狀青霉菌白色菌絲少許，接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中，培養(yǎng)一周后，即得活化的指狀青霉菌菌種。

在當(dāng)代插畫創(chuàng)作中，編織也是藝術(shù)家喜歡使用的工藝技法。毛氈材料和編織物的組合比單一的竹子或是其他天然材料更為奪目，尤其是它們顏色的碰撞和質(zhì)地的反差，使最終作品更加耀眼。其次，毛氈材料獨特的整體成型特性可以使作品更加立體，并帶來視覺上的升華。此外，毛氈材料柔軟且令人愉悅，帶來親膚感，并且不會使觀眾感覺到抵觸。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 在無菌環(huán)境下，在培養(yǎng)基內(nèi)加入少量無菌水，將孢子刮下，置于已滅菌的含有玻璃球的三角瓶內(nèi)，充分振蕩后用無菌脫脂棉過濾，制成孢子懸浮液。

強有力的工作體制和運行機制是服務(wù)型機關(guān)黨組織建設(shè)長效推進、取得實效的關(guān)鍵保障。要通過建立健全領(lǐng)導(dǎo)機制、部門聯(lián)動機制、經(jīng)費投入機制等措施，切實強化對服務(wù)型機關(guān)黨組織建設(shè)的工作部署、工作推進和投入保障。

1.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定 將制備好的指狀青霉菌菌餅接種在含有不同濃度抑菌液的液體培養(yǎng)基試管中，以不加竹醋液和殼聚糖的試管為對照組。28℃恒溫培養(yǎng)后連續(xù)觀察1周，以試管內(nèi)完全無菌絲生長的最小濃度為抑菌液對指狀青霉菌的最小抑菌濃度。

以法規(guī)的形式保護個人的知識產(chǎn)權(quán)，激發(fā)個人創(chuàng)新的積極性，創(chuàng)造更多享有自主知識產(chǎn)權(quán)的科研成果。但同時要協(xié)調(diào)好學(xué)校的權(quán)益，不能單純?yōu)榧ぐl(fā)創(chuàng)造者積極性而荒廢了國有資產(chǎn)的管理。在保證學(xué)校權(quán)益的基礎(chǔ)上，盡可能地激發(fā)廣大教師、科研人員創(chuàng)新的積極性，是高校國有資產(chǎn)管理面臨的重要課題［4］。

（2）病果率：

我資質(zhì)平平，對書法藝術(shù)雖從小熱愛，但一直沒得到老師指點，寫字千百萬個，除了寫得快，在美的方面乏善可陳。最近十幾年來，我在朋友的鼓勵下拿起毛筆寫字，先用右手，后用左手，耗費紙墨無數(shù)，但進步甚微。后來我發(fā)現(xiàn)，進步還是有的，但是表現(xiàn)在鋼筆字上。也就是說，我用毛筆學(xué)書，促進了鋼筆字的進步。這是意外的收獲。

從社會轉(zhuǎn)型與“九天”傳統(tǒng)的變遷史可以發(fā)現(xiàn)，“九天”一度固守傳統(tǒng)陣頭而傳承乏力，積極適應(yīng)社會變遷后實現(xiàn)了創(chuàng)新與超越。其實，“九天”傳統(tǒng)的變遷現(xiàn)象只是我國傳統(tǒng)體育面臨傳承與創(chuàng)新問題的冰山一角，隨著文化全球化和現(xiàn)代競技體育的強勢同化，眾多傳統(tǒng)體育都面臨了傳承與發(fā)展、創(chuàng)新與推廣、固守與超越的諸多難題?？v觀世界各國：古印度的瑜珈、韓國的跆拳道、日本的柔道等，面對外來文化的沖擊，這些傳統(tǒng)體育不斷轉(zhuǎn)型和創(chuàng)新，均已風(fēng)靡世界。

（1）失重率：采用稱量法測定，從每組隨機選取若干果實首先稱量處理前的質(zhì)量，然后每隔5 d分別稱量，并通過下式計算果實失重率。

要想防止和解決物流企業(yè)財務(wù)風(fēng)險，就必須做好建立、健全企業(yè)內(nèi)部財務(wù)控制機制體系的有效措施。物流企業(yè)財務(wù)內(nèi)部監(jiān)控工作建立在企業(yè)各項資金預(yù)算的基礎(chǔ)上，并且符合企業(yè)運作的整體利益。企業(yè)在充分運用實時財務(wù)信息的條件下，應(yīng)該及時監(jiān)督和控制公司整體經(jīng)營目標進展情況。同時，企業(yè)需要加強對資金流量加以監(jiān)控，其目的為確保企業(yè)經(jīng)營目標實現(xiàn)的情況下提升資金使用的效率。

（4）可溶性固形物：采用手持折光儀測定，每次測定重復(fù)3次；

1.2.4 椪柑果實的保鮮處理 選擇大小、色澤均勻的果實作為試驗用果。將果實分為4組，分別用蒸餾水（CK）、1.5%竹醋液（T1）、1%殼聚糖溶液（T2）以及竹醋液殼聚糖復(fù)配液（T3）（竹醋液含量1.5%，殼聚糖含量1%）浸泡1 min，蒸餾水浸泡的作為對照，處理完成后，將果實攤開自然風(fēng)干，置于室溫下貯藏，每隔5 d取樣檢測各項指標。

病果率（%）＝（每個處理中腐爛果數(shù)／每個處理中果實總數(shù)）×100

以上（5）（6）（7）的測定均參照曹建康等［18］的方法進行。

式中S為失重率（%）；m1為果實質(zhì)量差（g）；m2為果實質(zhì)量（g）。

（5）可滴定酸：采用酸堿中和法測定（結(jié)果以檸檬酸的量換算），每次測定重復(fù)3次；

（6）Vc含量：采用2，6-二氯酚靛酚滴定法測定，每次測定重復(fù)3次；

煤炭資源的開采除了會對人體、土地、空氣產(chǎn)生嚴重的破壞以外，對水資源的污染也極為嚴重。在煤炭開采的過程中會產(chǎn)生兩種形式的廢水。一種為礦井水，另一種則為洗煤水。無論是哪一種水，其中都含有大量的懸浮物、酸性物質(zhì)以及放射性物質(zhì)。與此同時，礦井水和洗煤水還會影響周圍淺層的地下水水質(zhì)、人與動植物一旦食用，后果可想而知。洗煤水不僅僅是煤炭清洗過后的臟水，它其中還含有洗煤過程中倒入的一些化學(xué)藥品。含有這種化學(xué)藥品的洗煤水一經(jīng)外流就會不斷的滲入地下，久而久之就會使得飲用水的質(zhì)量下降，而產(chǎn)生一系列不良的影響。

耕地是人類賴以生存的基本條件，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)，而且土地資源本身具備一定的環(huán)境修復(fù)功能，對地球表層的生態(tài)系統(tǒng)改造有很大影響。中國是農(nóng)業(yè)大國，但是耕地總面積較少，加上近年來城市化、工業(yè)化發(fā)展，導(dǎo)致一部分耕地資源逐漸變?yōu)榻ㄔO(shè)用地，加大了糧食安全生產(chǎn)壓力。

（7）MDA含量：利用紫外分光光度計測定吸光度值，再根據(jù)公式，計算得出。

（3）呼吸強度：采用紅外線CO2分析儀［17］測定；

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

全部數(shù)據(jù)采用Origin 8.5整理及繪圖；運用SPSS 22.0軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹醋液與殼聚糖的最小抑菌濃度（MIC）

椪柑果實在采收、運輸以及貯藏的過程中特別容易受到指狀青霉菌的侵染而腐爛。通過測定竹醋液及殼聚糖對以指狀青霉菌的MIC來確定椪柑保鮮劑的濃度配比。竹醋液及殼聚糖對指狀青霉菌的MIC見表1。竹醋液對指狀青霉菌的MIC為1.5%，殼聚糖對指狀青霉菌的MIC為0.8%。關(guān)于竹醋液對指狀青霉菌的抑制效果，試驗結(jié)果僅代表研究中所選用的竹醋液，因為竹醋液的成份是隨著制備竹醋液的竹材的品種和制備工藝的不同而變化的。

表1 竹醋液和殼聚糖對指狀青霉菌的最小抑菌濃度Tab.1 Minimum inhibitory concentration of bamboo vinegar and chitosan on Penicillium digitatum

由表1可以看出，無論是竹醋液還是殼聚糖，當(dāng)濃度達到一定程度的時候，都可以抑制指狀青霉菌的生長，這說明二者可以在一定程度上預(yù)防柑橘類果實的綠霉病。為了探究將竹醋液和殼聚糖復(fù)配使用的效果，在前期研究的基礎(chǔ)上，選用1%濃度的殼聚糖溶液做為成膜劑，然后在其中添加竹醋原液，使竹醋液濃度為1.5%（竹醋液濃度過高會導(dǎo)致保鮮劑有較大煙熏味，影響果實商品價值，因此選擇可以抑菌的最低濃度）。將二者復(fù)配后作為椪柑保鮮劑使用，并且和單獨使用二者做比較。

2.1.2 二階導(dǎo)數(shù)光譜 采用Perkin Elmer公司的Spectrum軟件中的求導(dǎo)功能，選擇13點平滑，獲得二階導(dǎo)數(shù)光譜圖。

1.2.5 柑果實測定指標及方法

2.2 竹醋液殼聚糖復(fù)合保鮮劑對椪柑果實失重率和病果率的影響

果實的失重率是判斷保鮮效果的重要指標之一。經(jīng)不同處理的椪柑果實失重率如圖1所示。由圖可見所有處理和對照組果實的失重率均隨著貯藏時間的延長而增加，這主要是由于果實自身的蒸騰作用和呼吸消耗導(dǎo)致果實的重量不斷下降。通過對比發(fā)現(xiàn)：T2處理組的果實失重率與CK相比差異不明顯（P＞0.05），而T1和T3 2個處理組的失重率明顯低于CK（P＜0.05）。這可能是由于T1和T3 2個處理中有殼聚糖存在，在果實表面形成了一層膜，從而抑制了果實的蒸騰作用。到貯藏的后期，T3處理組的失重率是最低的。

從表2可以看出，在貯藏的前11 d各處理組均沒有出現(xiàn)病果。CK組從第16 d開始出現(xiàn)病果，到第31 d時病果率為7.5%，是所有組中最高的。而T1、T2和T3各組處理均能不同程度的推遲出現(xiàn)病果的時間。單獨使用殼聚糖（T1）和竹醋液（T2），可以不同程度的抑制果實的腐爛，貯藏至31 d時，T1和T2組的果實腐爛率均低于CK。而將殼聚糖和竹醋液復(fù)配后使用（T3），直到貯藏第31 d才出現(xiàn)病果，并且到最后該組病果率最低，只有0.6%。這說明竹醋液和殼聚糖復(fù)配使用可以明顯降低果實病果率，其效果優(yōu)于二者單獨使用。

表2 不同處理對椪柑果實病果率的影響Tab.2 Effect of different treatments on the infection rate of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

2.3 竹醋液殼聚糖復(fù)合保鮮劑對椪柑果實呼吸強度的影響

呼吸作用是果蔬采后新陳代謝的最主要過程，通過呼吸作用將自身貯存的有機物氧化分解成自身生理活動所必需的能量和物質(zhì)原料。但呼吸作用過強，果蔬自身的營養(yǎng)物質(zhì)會很快被消耗，從而影響果蔬的商品價值。因此在貯藏過程中應(yīng)盡量控制果實的呼吸作用，使其處于正常范圍的最低水平，以延長果實貯藏期。由圖5可知，對照組和各處理組果實的呼吸強度在貯藏期間均呈下降趨勢，說明椪柑屬于典型的非呼吸躍變型果實。其中竹醋液處理組（T2）果實的呼吸強度和對照相比差異不顯著（P＞0.05），說明竹醋液處理對果實呼吸強度的影響不大。而T1和T3 2個處理組果實的呼吸強度在整個貯藏期間明顯低于CK和T2，差異顯著（P＜0.05）。這可能是殼聚糖涂膜處理在果實表面形成的膜延緩了果實和外界的氣體交換，從而抑制了呼吸作用。

圖1 不同處理對椪柑果實失重率的影響Fig.1 Effect of different treatments on weight loss rate of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

圖2 不同處理對椪柑果實呼吸強度的影響Fig.2 Effect of different treatments on respiratory intensity of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

2.4 竹醋液殼聚糖復(fù)合保鮮劑對椪柑品質(zhì)的影響

可溶性固形物主要包括可溶性糖類，還有少量有機酸、維生素、礦物質(zhì)等。從圖3可以看出，所有組的椪柑在貯藏期間，可溶性固形物含量都呈先上升后下降的趨勢，其原因可能是果實在貯藏前期，果實內(nèi)多糖的水解速度大于果實呼吸消耗，使單糖含量增加。在貯藏后期，呼吸消耗過程占優(yōu)，導(dǎo)致可溶性固形物含量下降。到貯藏的中后期（21～31 d），3個處理組果實的可溶性固形物含量均高于對照組。其中T3處理組效果最好，與CK相比，差異顯著（P＜0.05）。這說明竹醋液和殼聚糖復(fù)配使用，有利于果實維持較高的可溶性固形物含量，其效果優(yōu)于竹醋液和殼聚糖單獨使用。

圖3 不同處理對椪柑果實品質(zhì)指標變化的影響Fig.3 Effect of different treatment on quality indicators of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

Vc又名抗壞血酸，是一種普遍存在于水果蔬菜中的水溶性維生素，是椪柑果實的主要營養(yǎng)物質(zhì)之一。從圖3可看出，椪柑在貯藏期間，各組果實的Vc含量均呈下降趨勢。總體而言，3個處理組的果實的Vc含量在貯藏的中后期（11-31 d）明顯高于CK，差異顯著（P＜0.05）。但是各個處理組之間的Vc含量在整個貯藏期間差異不明顯（P＞0.05）。

可滴定酸是果實采后進行呼吸作用的主要底物之一，其含量直接影響果實風(fēng)味品質(zhì)。因此，在果實的采后貯藏過程中，如何有效延緩可滴定酸的降解則顯得尤為重要。由圖3可看出，隨著貯藏時間的延長，各處理組的可滴定酸含量均呈下降趨勢，這與萬春鵬等的研究結(jié)果一致［19］。在整個貯藏期間，3個處理組果實的可滴定酸含量均高于CK，差異顯著（P＜0.05）。其中處理T3效果最好，說明竹醋液＋殼聚糖復(fù)合涂膜處理能有效延緩果實可滴定酸含量的下降，保持果實良好營養(yǎng)品質(zhì)。

2.5 竹醋液殼聚糖復(fù)合保鮮劑對椪柑果實丙二醛含量和過氧化物酶活性的影響

丙二醛（MDA）是膜脂過氧化作用最主要的產(chǎn)物之一。一般來說，MDA含量越低，說明果實受到的傷害越小，其保鮮效果越好。由圖4可以看出，椪柑的MDA含量隨著貯藏時間的延長而增加，這與鄧利珍等的研究結(jié)果一致［20］。到了貯藏的中后期（21-31 d），3個處理組果實的MDA含量均低于CK，差異顯著（P＜0.05）。其中處理T3的MDA含量最低，與其它各組相比差異顯著（P＜0.05）。這說明竹醋液和殼聚糖復(fù)合涂膜可以有效的抑制椪柑果實的膜脂過氧化作用，其效果優(yōu)于二者單獨使用。

圖4 不同處理對椪柑果實丙二醛含量和過氧化物酶活性的影響Fig.4 Effect of different treatments on malondialdehyde content and peroxidase activity of Citrus reticulata cv.Ponkan fruit

過氧化物酶（POD）是果實體內(nèi)清除活性氧自由基的重要保護酶，對維持活性氧、自由基代謝平衡具有重要作用。POD活性水平較高，表明果實清除活性氧能力強，有利于椪柑果實貯藏。如圖4所示，各個處理組和CK的POD活性在整個貯藏期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。其中T1和T3 2個處理組的POD活性明顯高于T1和CK，差異顯著（P＜0.05）。特別是T3處理組的POD活性是所有處理中最高的，說明竹醋液和殼聚糖復(fù)合涂膜促進椪柑果實POD活性升高，使其維持較高水平，有利于果實的貯藏保鮮。

3 結(jié)論與討論

研究表明，竹醋液和殼聚糖對指狀青霉菌均有抑制作用。將二者結(jié)合使用可以降低椪柑果實在貯藏期間的病果率和失重率，并且效果優(yōu)于二者單獨使用。其原因可能是竹醋液和殼聚糖相結(jié)合可以有效抑制以指狀青霉菌為主的一系列柑橘采后病原微生物的活動，從而抑制了椪柑果實的腐爛。此外，由于殼聚糖在果實表面形成了薄膜，可以有效抑制果實體內(nèi)水分的蒸發(fā)，因此降低了果實的失重率。果實采收離開母體后是活體組織，依然在進行各種新陳代謝活動。果實體內(nèi)貯存的可溶性固形物、可滴定酸等物質(zhì)可以作為呼吸底物被不斷消耗，Vc等不斷的被氧化，所以到了貯藏的中后期這些物質(zhì)含量會不斷下降。此外果實在采后貯藏過程中，組織逐漸衰老，細胞內(nèi)會大量積累活性氧自由基等物質(zhì)，使得細胞發(fā)生膜脂過氧化，POD是果實體內(nèi)清除超氧陰離子和過氧化物的重要保護酶。研究的結(jié)果表明：竹醋液和殼聚糖復(fù)合涂膜能有效的抑制椪柑果實采后的呼吸作用以及體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，有效降低MDA含量，較好的保持果實中POD的活性，且效果優(yōu)于二者單獨使用。本次研究證明竹醋液對危害柑橘類果實的主要病原微生物-指狀青霉菌具有很好的抑制作用，在殼聚糖的配合下，對椪柑果實防腐保鮮效果良好。竹醋液是一種來源于竹子的天然物質(zhì)，與化學(xué)防腐保鮮劑相比，具有來源廣泛、對環(huán)境無污染、操作簡單等優(yōu)點。將來有望用于柑橘類果實的貯藏保鮮。我國是世界上的主要產(chǎn)竹國之一，每年有大量的竹醋液產(chǎn)生，研究也為竹醋液的應(yīng)用開辟了一條新的途徑。