大通牦牛TLR2基因序列特征分析

彭帥，陳朗，鄭天宇，陸會(huì)寧，張麗，劉麗霞

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030）

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）位于單核/巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞表面，同時(shí)也表達(dá)于上皮/牛胚氣管細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中，能識(shí)別細(xì)菌、病毒、寄生蟲等多種病原微生物，是動(dòng)物機(jī)體重要的模式識(shí)別受體[1,2]。自Medzhitov等[3]發(fā)現(xiàn)第一個(gè)TLRs以來(lái)，至今已有10余個(gè)家族成員[4]。它們通過(guò)感知病原微生物（如細(xì)菌、真菌等）表達(dá)的特異性結(jié)構(gòu)，即病原分子相關(guān)模式（PAMPs）和某些內(nèi)源性配體，傳導(dǎo)病原微生物入侵信號(hào)并釋放炎癥因子等免疫活性物質(zhì)，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答，進(jìn)一步激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5]。TLR2是一種跨膜糖蛋白，能夠識(shí)別病原體的細(xì)胞壁成分，激活免疫細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，使機(jī)體產(chǎn)生抗病性。目前，已經(jīng)證實(shí)牛TLR2基因被定位于17號(hào)染色體上[6]。TLR2作為固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的橋梁，在機(jī)體中發(fā)揮著重要作用[7]，成為?？共∮N的候選標(biāo)記基因。

近年來(lái)，研究者對(duì)牛TLR2基因的結(jié)構(gòu)功能、多態(tài)性及其與疾病的相關(guān)性做了大量研究。孫麗萍等研究表明，牛TLR2存在3個(gè)突變位點(diǎn)[8]。林寶山等利用熒光定量PCR，研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因在牦牛小腸中有高表達(dá)現(xiàn)象[9]，且TLR2能識(shí)別并結(jié)合牛腸中的微小隱孢子蟲[10]。董慧敏[11]、葉小康[12]研究發(fā)現(xiàn)，病原微生物感染奶牛子宮后TLR2基因mRNA表達(dá)量明顯增加，并分析了其與子宮內(nèi)膜炎的關(guān)聯(lián)性。Bhaladhare等發(fā)現(xiàn)牛TLR2基因存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，并分析了其與結(jié)核病的相關(guān)性[13]。這些研究表明TLR2基因與許多免疫性疾病有關(guān)聯(lián)，并在調(diào)控免疫機(jī)理方面具有重要作用。

目前，有關(guān)大通牦牛TLR2基因的生物信息學(xué)研究還未見(jiàn)報(bào)道，為進(jìn)一步探究其功能和作用機(jī)理，本研究采用DNA混合池?cái)U(kuò)增后直接測(cè)序的方法獲得大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)（編碼區(qū)Coding regions），并利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析大通牦牛TLR2蛋白的結(jié)構(gòu)功能，為揭示該基因的基本性質(zhì)和功能信息以及大通牦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)血樣

本研究的試驗(yàn)血樣采自青海大通牦牛種牛場(chǎng)的55頭大通牦牛，對(duì)其進(jìn)行頸靜脈采血，采全血10mL，加ACD抗凝劑抗凝，利用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿法抽提基因組DNA[14]。大通牦?；蚪MDNA以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的奶牛TLR2基因序列（登錄號(hào)AF368419），并引用周峰等已經(jīng)設(shè)計(jì)好的TLR2基因特異性引物[15]，分成五段進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為522bp、822bp、574bp、526bp、599bp（表1）。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)引物序列

1.3 DNA混合池構(gòu)建與PCR擴(kuò)增

55個(gè)大通牦?；蚪MDNA樣品各取2μL，構(gòu)建一個(gè)DNA混合池，以DNA混合池為模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為20μL：DNA模板0.8μL，上下游引物各0.4μL，2×Power Taq PCR Master Mix 11μL，ddH2O 7.4μL。PCR條件：94℃ 5min預(yù)變性，94℃ 30s變性，58.5℃ 30s退火，72℃ 50s延伸，30次循環(huán)，72℃10min延伸，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 序列測(cè)定與拼接

五段PCR產(chǎn)物直接送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行純化后雙向測(cè)序，并使用MEGA6軟件[16]對(duì)大通牦牛TLR2基因CDS區(qū)進(jìn)行拼接。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站對(duì)大通牦牛TLR2蛋白結(jié)構(gòu)、功能等進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，所用軟件及網(wǎng)站見(jiàn)表2。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 大通牦牛TLR2蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析

利用BioEdit軟件和ExPASy的在線程序Protparam預(yù)測(cè)TLR2蛋白的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸組成等基本性質(zhì)（表3）。結(jié)果顯示，大通牦牛TLR2基因編碼784個(gè)氨基酸，20種氨基酸占比見(jiàn)圖1，亮氨酸（Leu）最多，占總氨基酸的15.43%，甲硫氨酸（Met）占比最少（1.40%）。

表3 大通牦牛TLR2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)

圖1 大通牦牛TLR2蛋白質(zhì)氨基酸組成

2.2 大通牦牛TLR2跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

應(yīng)用TMHMM Server V.2.0分析跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，大通牦牛TLR2蛋白可能是由胞外區(qū)（1～587aa）、跨膜區(qū)（588～610aa）、胞內(nèi)區(qū)（611～784aa）三部分組成的跨膜蛋白（圖2）。利用CDD工具[22]預(yù)測(cè)TLR2蛋白膜外區(qū)富集亮氨酸重復(fù)序列，可輔助識(shí)別病原微生物。

圖2 大通牦牛TLR2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 大通牦牛TLR2蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

運(yùn)用Signal P4.1軟件預(yù)測(cè)大通牦牛TLR2蛋白的N端信號(hào)肽及剪切位點(diǎn)，其準(zhǔn)確度可達(dá)96%[23]。結(jié)果顯示，Cmax（0.692）、Ymax（0.800）均趨向于+1，S值在剪切位點(diǎn)之前連續(xù)偏高，剪切位點(diǎn)之后急劇降低，說(shuō)明大通牦牛TLR2具有信號(hào)肽，剪切位點(diǎn)存在于20～21位氨基酸之間（圖3）。

圖3 大通牦牛TLR2信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

圖4 大通牦牛TLR2蛋白N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用CBS的在線程序NetNGlyc預(yù)測(cè)大通牦牛TLR2蛋白的N-糖基化位點(diǎn)（圖4）。結(jié)果顯示，TLR2蛋白具有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，分別為114位點(diǎn)、199位點(diǎn)和442位點(diǎn)。

2.5 大通牦牛TLR2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用在線程序（RNA fold web server 服務(wù)器）預(yù)測(cè)大通牦牛TLR2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）。結(jié)果顯示，其自由能為-677.40 kcal/mol，與荷斯坦牛二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能相差微小，但二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)型發(fā)生明顯變化[24,25]。

圖5 大通牦牛TLR2 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論

TLR2作為TLRs的家族成員之一，活性居于前列，可與其他TLRs（如TLR1、TLR6）以及受體（如CD14）結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫效應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于人及荷斯坦牛、鼠、鴨和羊等動(dòng)物TLR2基因的研究已有大量報(bào)道[24～28]。

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析TLR2基因的結(jié)構(gòu)及功能。從預(yù)測(cè)結(jié)果看，TLR2蛋白是由784個(gè)氨基酸組成的不穩(wěn)定親水性跨膜蛋白質(zhì)。大通牦牛TLR2蛋白理論等電點(diǎn)為6.46，由此可判斷大通牦牛TLR2蛋白是一種弱酸性蛋白質(zhì)。研究表明蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)大于40為不穩(wěn)定蛋白，反之則為穩(wěn)定蛋白[29]，大通牦牛TLR2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.22，屬于不穩(wěn)定蛋白。依據(jù)總平均親水性（-0.120），可判斷大通牦牛TLR2蛋白是可溶性蛋白。通常蛋白質(zhì)半衰期越長(zhǎng)其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，大通牦牛TLR2蛋白半衰期為30h，但其卻是不穩(wěn)定蛋白，可能由于不同基因發(fā)揮不同功能而產(chǎn)生的相反結(jié)果。大通牦牛TLR2蛋白是由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成的跨膜蛋白，與南陽(yáng)黃牛TLR2蛋白組成一致[15]。研究表明牛TLR2可通過(guò)NF-Κb途徑誘導(dǎo)白細(xì)胞介素-1β的產(chǎn)生[30]，大通牦牛TLR2蛋白可能含有20個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，南陽(yáng)黃牛TLR2蛋白含有21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽[15]，差別可能由于TLR2在不同種屬之間指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移及分泌的功能強(qiáng)度差異所造成。蛋白質(zhì)糖基化修飾對(duì)蛋白質(zhì)折疊、分選及其定位有重要影響，大通牦牛TLR2蛋白具有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，可能與其抗病性有關(guān)聯(lián)。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)同荷斯坦牛有明顯變化，可能與其優(yōu)越的抗寒性有關(guān)聯(lián)。

本研究對(duì)大通牦牛TLR2蛋白的理化性質(zhì)和功能結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，此后可在此基礎(chǔ)上深入研究TLR2基因的相對(duì)表達(dá)量，為大通牦牛的抗病育種提供理論基礎(chǔ)。