山楂多糖提取工藝優(yōu)化及其降血糖、降血脂活性

鐘麗霞,江震宇,汪嘉妮,李旭楓,徐麗珊

(浙江師范大學化學與生命科學學院,浙江金華 321004)

山楂(CrataeguspinnatifidaBunge),薔薇科山楂屬植物,是我國一種藥食兩用的果品[1]。其種植面積廣,產(chǎn)量可觀,民間常用于降血糖、降血脂。據(jù)報道,山楂富含多糖、多酚、有機酸、三萜、甾醇、胡蘿卜素、氨基酸等化學成分及微量元素[1-3],其中多糖是山楂中一類重要的生物活性物質(zhì)。多糖又稱多聚糖,是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵,并以糖苷鍵線性或分支連接而成的鏈狀聚合物。研究發(fā)現(xiàn),多糖除了可以作為植物的貯藏養(yǎng)料和骨架成分外,還具有降血脂、降血糖、增強免疫力、抑癌、抑菌等一系列重要生物學功能[4-7]。

近年來,已經(jīng)有學者對枸杞多糖[8]、蘆薈多糖[9]進行深入研究,表明多糖具有誘人的開發(fā)價值和廣闊的市場前景。目前對山楂多糖提取工藝的研究尚少,且現(xiàn)有的研究多是熱水浸提、超聲提取工藝,關(guān)于微波輔助提取山楂多糖工藝的研究很少,鮮有文獻對優(yōu)化提取工藝后提取的山楂多糖進行進一步的活性探究。微波輔助提取技術(shù)[10]是國內(nèi)外常用的植物活性成分提取技術(shù),其主要是依靠微波加速活性成分的溶出。人體內(nèi)血糖及血脂的代謝過程受多種酶的調(diào)控,通常以酶為靶標,研究各類活性物質(zhì)對血糖、血脂代謝的作用[11]。

因此,本試驗采用單因素實驗法和響應面法優(yōu)化微波輔助提取山楂多糖的工藝條件,并通過體外測定山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的活性及DPPH·清除能力,研究其降血糖、降血脂活性,以期為山楂資源的開發(fā)利用及山楂源保健產(chǎn)品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山楂(山里紅) 浙江金華醫(yī)藥公司,新鮮山楂去核后放入60 ℃烘箱中,烘干至恒重,粉碎機粉碎過篩,貯存于干燥環(huán)境中待用;1,1-二苯-2-苦肼基(DPPH·)、胰脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯基丁酸酯(PNPB)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、膽酸鈉及?；悄懰徕c 美國Sigma公司;無水乙醇、正丁醇、氯仿等有機試劑 均為國產(chǎn)分析純。

FW135粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海恒科技有限公司;BSA-224S電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司;MDS-8G微波消解儀 上海新儀微波化學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山楂粗多糖的提取 采用微波輔助提取乙醇沉淀法提取山楂多糖。山楂粉采用石油醚以1∶2 (g/mL)的料液比萃取除去脂溶性物質(zhì),每次15 min，重復三次,抽濾烘干。一定質(zhì)量的山楂粉和去離子水按一定固液比(g/mL)充分混勻后,進行微波輔助提取,提取液于4 ℃,4500 r/min離心10 min,取上清液濃縮、干燥后復溶于一定量的去離子水,按四倍體積的量加入無水乙醇沉淀12 h;4500 r/min離心20 min,沉淀烘干得到山楂多糖提取物。將山楂多糖提取物復溶于去離子水中,以液固比3∶1 (mL/g)用活性炭吸附法除色素;取脫色素后的樣品液以樣品液與Sevag試劑體積比3∶1在恒溫水浴搖床振蕩(200 r/min)20～30 min,400 r/min離心20 min,取少量上清液測定蛋白的質(zhì)量,重復處理5次,除蛋白后冷凍干燥得到山楂粗多糖。

1.2.2 多糖提取物提取量測定及多糖含量測定 多糖提取物提取量計算公式如下:

多糖提取物提取量(mg/g)=a/m

式中:a為山楂多糖提取物的質(zhì)量,mg;m為除去脂溶性物質(zhì)后山楂粉的質(zhì)量,g。

多糖含量測定[12]:取1 mL山楂粗多糖溶液于試管中,浸于冰浴中冷卻,再加入4 mL蒽酮試劑,沸水浴10 min,取出用自來水冷卻后比色。用不同濃度的標準葡萄糖溶液代替山楂粗多糖溶液制標準曲線,標準曲線公式為:y=10.056x+0.0113,R2=0.997,y為待測液糖質(zhì)量濃度,x為標準葡萄糖溶液。測得的吸光度值由標準曲線查算出山楂粗多糖溶液的糖含量。多糖含量按照以下方程進行計算:

W(%)=CV/m×100

式中,W為糖的質(zhì)量分數(shù),C為從標準曲線上查出的糖質(zhì)量濃度,mg/mL;V為樣品稀釋后的體積,mL;m為樣品的質(zhì)量,mg。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取功率對山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,提取時間9 min,固液比1∶30 (g/mL),考察不同微波功率(300、400、500、600、700 W)對山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.2 提取時間對山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,固液比1∶30 (g/mL),固定微波功率500 W,考察不同提取時間(3、6、9、12、15 min)對山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.3 提取溫度對山楂多糖提取物提取量的影響 固定微波功率500 W,提取時間6 min,固液比1∶30 (g/mL),考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.3.4 固液比對山楂多糖提取物提取量的影響 固定提取溫度60 ℃,提取時間6 min,固定微波功率500 W,考察不同固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 (g/mL))對山楂多糖提取物提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,利用響應面分析法優(yōu)化山楂多糖提取物的提取工藝。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,并綜合單因素實驗結(jié)果,以提取溫度(A)、提取時間(B)、提取功率(C)為3個影響因素,以山楂多糖提取量為響應值。采用統(tǒng)計分析軟件Design-Expert 8.0,建立3因素3水平的響應面分析法,進行二次多項回歸方程擬合及其優(yōu)化分析。響應面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 山楂粗多糖降血糖、降血脂活性測定

1.2.5.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定 50 μL山楂粗多糖溶液與50 μLα-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL)(以pH6.8磷酸鉀緩沖鹽配制)混勻后,于37 ℃水浴鍋上溫浴5 min,再加入100 μL 5 mmol/L 以相同緩沖鹽配制的對硝基苯基葡萄糖苷(PNPG)溶液進行反應,于405 nm處測定反應體系的酶動力曲線。以等量的pH6.8磷酸鉀緩沖鹽溶液代替樣品溶液作為空白組,同樣操作,測得反應體系的酶動力曲線[13]。以阿卡波糖作為陽性對照。按照以下方程計算α-葡萄糖苷酶活性抑制率。

抑制率(%)=(1-k1/k2)×100

式中,k1和k2分別是樣品組和空白組酶動力曲線斜率k值。

1.2.5.2 胰脂肪酶抑制活性的測定 取50 μL山楂粗多糖溶液與100 μL酶液(以pH8.0 Tris-HCl緩沖液配制)混勻后,置于37 ℃恒溫箱內(nèi)預熱5 min,然后注入100 μL底物溶液,于405 nm處測定反應體系的酶動力曲線。以等量的Tris-HCl緩沖溶液代替樣品溶液作為空白組,同樣操作,測得反應體系的酶動力曲線[14]。以奧利司他為陽性對照。按照以下方程計算胰脂肪酶活性抑制率。

抑制率(%)=(1-k1/k2)×100

式中,k1和k2分別是樣品組和空白組的酶動力曲線斜率k值。

1.2.5.3 DPPH·自由基清除效果的測定 將不同濃度的山楂粗多糖溶液和VC溶液(陽性對照)各2 mL與0.15 mmol/L 的DPPH自由基溶液(無水乙醇配制,2 mL,混勻避光反應30 min,在517 nm處測吸光度值(Ai);將不同濃度的山楂粗多糖溶液和VC溶液各2 mL與2 mL去離子水混勻后,避光反應30 min,于517 nm處測定吸光值(Ab);2 mL去離子水與2 mL DPPH·溶液混勻后,避光反應30 min,于517 nm處測定吸光值(Ac),重復三次[15]。按照以下方程計算DPPH·自由基清除率。

清除率(%)=[1-(Ai-Ab)/Ac]×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有數(shù)值均為3次以上測定值,以平均值±標準偏差表示,實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析,p<0.01為差異極顯著,p<0.05為差異顯著,p>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取功率對山楂多糖提取物提取量的影響 微波功率對山楂多糖提取物提取量的影響如圖1所示。由圖1可知,當微波功率由300 W上升到500 W時,山楂多糖提取物提取量隨之增加,在500 W時達到最大值(118.63±0.46) mg/g,600 W后含量變化趨于平緩。主要原因是隨著微波功率的增加,產(chǎn)生的熱效應增加,提高山楂多糖的分子動能,使山楂多糖釋放并溶于溶劑中;當功率大于500 W時,山楂多糖提取物的提取量下降,可能是瞬間溫度上升,使部分多糖降解,導致提取量降低。因此,選取500 W為最佳微波功率。

圖1 提取功率對山楂多糖提取物提取量的影響Fig.1 Effect of extraction power on extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.2 提取時間對山楂多糖提取物提取量的影響 提取時間對山楂多糖提取物提取量的影響如圖2所示。由圖2可知,山楂多糖提取量隨著提取時間的增加先增加后降低,在6 min時達到最大值(136.50±0.07) mg/g。這是因為微波時間較短時,山楂多糖析出不充分,提取率降低;但時間過長,在微波的作用下部分山楂多糖結(jié)構(gòu)被破壞,從而對提取量造成影響。因此,最佳的提取時間為6 min。

圖2 提取時間對山楂多糖提取物提取量的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.3 提取溫度對山楂多糖提取物提取量的影響 提取溫度對山楂多糖提取物提取量的影響如圖3所示。由圖3可知,隨著提取溫度的增加,山楂多糖提取物提取量先增加后減小,在60 ℃達到最大值(117.94±0.09) mg/g,之后便開始下降。這可能是因為在溫度過高的情況下,其他物質(zhì)溶出,增加了溶液的粘稠度,阻礙了多糖的溶出,從而降低了提取量。因此,選取60 ℃為最佳提取溫度。

圖3 提取溫度對山楂多糖提取物提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.1.4 固液比對山楂多糖提取物提取量提取的影響 固液比對山楂多糖提取物提取量的影響如圖4所示。由圖4可知,山楂多糖提取物提取量隨著固液比的下降先上升后下降再小幅度上升。隨著固液比的下降,溶液的黏度下降,有利于多糖的擴散和溶出;當固液比為1∶30 (g/mL)時,山楂多糖提取物提取量最高。因固液比對山楂多糖提取物提取量的影響相較于其他三個因素影響較弱,故不作為響應因子進行進一步優(yōu)化。綜上實際情況等因素,選擇固液比為1∶30 (g/mL)。

圖4 固液比對山楂多糖提取物提取量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.2 響應面優(yōu)化山楂多糖提取工藝

2.2.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果 以山楂多糖提取物提取量為試驗指標,根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,設(shè)計三因素三水平分析實驗,試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

2.2.2 回歸模型顯著性檢驗及方差分析 通過Design-Expert 8.05b響應面分析軟件分析,方差分析如表3所示。得到山楂多糖提取物提取量(Y),提取溫度(A)、提取時間(B)、提取功率(C)的二次多項回歸方程為:Y=143.65+14.44A+11.75B-2.46C+3.15AB-7.03AC+5.58BC-22.81A2-18.17B2-24.34C2。F檢驗顯示,模型具有很高的F值和極低的p值(p<0.01),說明模型高度顯著。失擬項為0.3279,沒有達到顯著水平,表明所建立的回歸模型可以用來分析該工藝條件。在一次項中的A、B以及二次項中的A2、B2、C2、AC、BC對山楂多糖提取物提取量的影響達到極顯著水平(p<0.01),一次項中的C以及二次項中的AB達到顯著水平(p<0.05),這表明這3個因素與山楂多糖提取物提取量有直接的關(guān)系,是影響提取率的主要因子。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.2.3 交互作用分析 響應面圖形是控制其中一個因素在0水平,響應值對應其余兩個因素所做的三維曲面圖和等高線圖,其可以直觀地反映出各因素及其兩兩之間的交互作用對響應值的影響[16-17]。由圖5(a)可以看出,提取時間和提取溫度具有明顯的交互作用,響應面坡度都比較陡峭,說明響應值受提取時間和提取溫度的影響均較大。當提取功率一定時,山楂多糖提取物提取量隨著提取時間的增長而增大,達到最大值后變?yōu)橄陆?而溫度對響應值的影響也與其相類似;圖5(b)顯示,提取功率與提取時間也具有明顯的交互作用,固定提取溫度不變,隨著提取功率的增大,山楂多糖提取物提取量先升高后降低,微波功率在300～500 W的區(qū)間內(nèi)提取量上升較快,提取時間對山楂多糖提取物提取量的影響也呈現(xiàn)此規(guī)律;圖5(c)顯示,提取功率與提取溫度之間具有明顯的交互作用,當提取時間一定時,山楂多糖提取物提取量隨著提取功率的增大而增多,達到最大值后隨即降低,提取溫度對山楂多糖提取物提取量的影響也與之相類似。

圖5 各因素交互作用對山楂多糖提取物提取量的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on the yield of polysaccharide extract from hawthorn

2.2.4 最佳工藝條件確定與驗證 通過Design-Expert 8.05b軟件分析,山楂多糖提取物提取的最佳條件是功率493.81 W,提取時間7.03 min,提取溫度63.49 ℃。在最佳提取條件下預測山楂多糖提取物提取量的最大值為148.28 mg/g。綜合考慮實際,確定最后修正的最佳工藝條件為:功率500 W,提取時間7 min,提取溫度63 ℃,在修正條件下驗證試驗,結(jié)果顯示山楂多糖提取物提取量為(147.10±0.32) mg/g,與模型預期值差異不顯著。說明該優(yōu)化結(jié)果可靠,可以用于山楂多糖的提取工藝。

通過上述最優(yōu)條件得到的山楂多糖提取物,其中多糖含量達39.32%±0.80%。

2.3 山楂粗多糖降血糖、降血脂活性測定

2.3.1 山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率 山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率的結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,在試驗范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,α-葡萄糖苷酶抑制率呈逐漸上升趨勢,經(jīng)測定山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為(99.22±0.89) μg/mL。以阿卡波糖為陽性對照,測得其對α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值為0.16 μg/mL?？梢娚介侄嗵菍Ζ?葡萄糖苷酶具有較好的抑制作用,說明山楂粗多糖具有降血糖的功效。

圖6 不同濃度山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.6 Inhibition rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations on α-glucosidase

2.3.2 山楂粗多糖對胰脂肪酶抑制率 山楂粗多糖對胰脂肪酶的抑制率結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,在試驗范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,胰脂肪酶抑制率呈逐漸上升趨勢,經(jīng)測定山楂粗多糖對胰脂肪酶抑制率的IC50值為(22.50±0.79) mg/mL。以奧利司他為陽性對照,測得其對胰脂肪抑制率的IC50值為0.91 mg/mL。說明山楂粗多糖具有較好的降血脂作用。

圖7 不同濃度山楂粗多糖對胰脂肪酶的抑制率Fig.7 Inhibition rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations on pancreatic lipase

2.3.3 山楂粗多糖對DPPH·的清除能力 山楂粗多糖對DPPH·的清除能力結(jié)果如表5所示。由表5可以看出,在試驗范圍內(nèi)隨著山楂粗多糖質(zhì)量濃度的升高,DPPH·清除率呈上升趨勢,經(jīng)測定山楂粗多糖對DPPH·清除率的IC50值為(185.80±0.64) μg/mL。以VC陽性對照,測得其對DPPH·清除率的IC50值為8.81 μg/mL。說明山楂粗多糖具有較好的抗氧化作用,山楂粗多糖是山楂具有良好抗氧化功能的主要物質(zhì)。在正常情況下體內(nèi)含有一定的自由基,當體內(nèi)的自由基超過一定額度以后對人體造成一定的傷害,引起一系列慢性疾病,如高血糖、高血脂,故測定DPPH自由基清除率對山楂粗多糖降血糖、降血脂的研究具有一定的指導意義。

圖8 不同濃度山楂粗多糖對DPPH·清除率Fig.8 DPPH· scavenging rate of hawthorn crude polysaccharides with different concentrations

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過響應面法對微波提取山楂提取物進行工藝優(yōu)化,得到其最佳工藝條件為:提取溫度63 ℃,微波功率500 W,提取時間7 min,在此條件下山楂多糖提取量為(147.10±0.32) mg/g。山楂粗多糖對α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶具有較好的抑制作用,對DPPH·具有良好的清除能力,其IC50分別為(99.22±0.89)、(22.50±0.79)、(185.80±0.64) μg/mL,說明山楂粗多糖中具有降血糖、降血脂的活性成分,為山楂的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。