基于化合物與蛋白互作分析根皮苷的降糖機制

冉軍艦,雷 爽,阮曉莉,梁新紅,焦凌霞,趙瑞香

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南省高校重點實驗室培育基地, 新鄉(xiāng)市農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,河南新鄉(xiāng) 453003)

糖尿病是一類慢性非傳染性疾病,目前全球患糖尿病的人數(shù)已經(jīng)達到3.46億,而且有上升的趨勢,糖尿病是由于胰島素分泌不足或胰島素抵抗導(dǎo)致血糖升高的一類疾病,引起機體糖代謝紊亂,進而會導(dǎo)致神經(jīng)病變、心血管病變、腎功能衰竭、視網(wǎng)膜病變等各類并發(fā)癥,死亡率較高[1]。目前糖尿病治療主要以西藥為主[2],但其存在著嚴重的副作用,因此尋找天然有機功能因子替代當前藥物治療具有重要的現(xiàn)實意義。

根皮苷是蘋果中的特征酚類物質(zhì),在不同蘋果品種或者蘋果不同生長時期中差異較大[3],根皮苷對蘋果的風(fēng)味和色澤有重要的作用[4]。另外根皮苷在蘋果多酚中具有顯著的功能活性,已經(jīng)證明根皮苷具有調(diào)節(jié)血壓、降低血糖、清除體內(nèi)自由基、保護心臟、預(yù)防和治療糖尿病等作用[5-7]。也有研究表明,根皮苷可以作為糖類運輸?shù)母偁幮砸种苿?從而降低人體對蔗糖、3-O-甲基葡萄糖、葡萄糖的攝取量[8],抑制糖尿病的發(fā)生。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein interaction network,PIN)在蛋白功能之間相關(guān)性、化合物與蛋白互作關(guān)系、蛋白與疾病相關(guān)性等方面有重要的作用[9],作為系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)重要研究內(nèi)容,其中的蛋白及其相互作用是細胞組織和功能的基礎(chǔ),起到調(diào)控機體健康和疾病狀態(tài)的作用[10]。本研究以蘋果中根皮苷為研究對象,通過數(shù)據(jù)分析確定其作用靶點,利用靶點相關(guān)信息構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),對其進行模塊分析及功能注釋,從分子網(wǎng)絡(luò)水平系統(tǒng)探討根皮苷的降糖機制,為根皮苷治療糖尿病的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 根皮苷對應(yīng)靶點信息的篩選

選取蘋果中的特征酚根皮苷對其進行成分靶點的數(shù)據(jù)挖掘。根皮苷作用的靶點有兩個來源:一個是化合物-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STITCH(http://stitch.embl.de/),另一個是歐洲生物信息研究所(European Bioinformatic Institute,EBI)提供的靶點生物活性數(shù)據(jù)平臺ChEMBL(http://www.ebi.ac.uk/chembl/)(截至2018年11月)。為了保證數(shù)據(jù)的可靠性,在STITCH 數(shù)據(jù)庫選擇匹配值大于0.7的化合物對應(yīng)的靶點作為研究對象。這兩個數(shù)據(jù)庫能夠顯示已知蛋白和化學(xué)物之間的親緣關(guān)系,并能過濾網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)只顯示與選定組織相關(guān)的蛋白。本文通過數(shù)據(jù)庫篩選去除重復(fù)的靶點。

1.2 根皮苷蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

本研究選取的根皮苷靶點蛋白相互作用(Protein-protein interaction networks,PPI)信息來源于String數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)。String數(shù)據(jù)庫收集整合表達蛋白和細胞功能相關(guān)信息,預(yù)測蛋白與蛋白之間相互作用,包括物理交互作用和功能交互作用,這些預(yù)測信息從系統(tǒng)共表達分析、跨基因組共享選擇性信號檢測、文獻自動化文本挖掘和基于基因的生物相互作用的計算轉(zhuǎn)移等途徑獲得。所以數(shù)據(jù)庫會對每一組數(shù)據(jù)進行打分,本研究選取分值高于0.7的高置信度的數(shù)據(jù),以確保數(shù)據(jù)的可靠性。將得到的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0,利用Advance Network Merge[11]插件去除重復(fù)邊和自環(huán)邊,取最大連通子圖作為根皮苷的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape是一個廣泛應(yīng)用的生物信息學(xué)軟件,用于生物網(wǎng)絡(luò)可視化和數(shù)據(jù)集成,每個節(jié)點(node)是基因、分子或者蛋白質(zhì),節(jié)點之間的線(edge)是分子之間的相互作用。

1.3 網(wǎng)絡(luò)模塊篩選與分析

蛋白質(zhì)通常不能單獨表現(xiàn)生物過程和分子功能,而是通過相互作用形成功能模塊,實現(xiàn)其生物及生理功能。MCODE[12]是分子復(fù)合物檢驗算法,能夠快速聚類并對模塊中蛋白的關(guān)聯(lián)程度打分。因此,本研究采用MCODE算法對構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行模塊分析,默認參數(shù)(Degree Cutoff:2,Node Score Cutoff:0.2,K-Core:2,Max. Depth:100)作為網(wǎng)絡(luò)模塊的截止標準。然后利用Biological Networks Gene Ontology tool(BinGO)插件[13]對識別出的模塊進行GO富集分析,蛋白的基因本位和GO注釋信息均來自Gene ontology數(shù)據(jù)庫(http://www. geneontology. org/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根皮苷對應(yīng)靶點信息

按照1.1的方法篩選獲得21個根皮苷的作用靶點基因信息,靶點信息在表1中列出。在獲得的靶點中,SLC5A2(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族5/成員2)、SLC5A1(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族5/成員1)、SLC5A11(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族5/成員11)、SLC5A4(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族5/成員4)、SLC2A2(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族2/成員2)、SLC29A1(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族29/成員1)、SLC28A1(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族28/成員1)、SLC28A2(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族28/成員2)、SLC28A3(鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族28/成員3)是葡萄糖吸收與水分吸收過程中重要節(jié)點;LCT(乳糖酶)主要與小腸內(nèi)乳糖分解有關(guān);BCHE(膽堿酯酶)主要與乙酰膽堿水解有關(guān),糖尿病患者膽堿酯酶顯著增高。由此推斷,根皮苷可能通過參與葡萄糖與水的吸收過程、乳糖的分解過程發(fā)揮降糖作用。

表1 根皮苷靶點信息Table 1 The targets information of phloridzin

2.2 根皮苷與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選的21個靶點信息輸入STRING下載所有相關(guān)基因?qū)隒ytoscape軟件,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò),結(jié)果如圖1所示,該網(wǎng)絡(luò)包含170個節(jié)點和545條邊。

圖1 根皮苷的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The protein interaction network of phloridzin

2.3 網(wǎng)絡(luò)模塊識別與分析

對構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析,利用軟件中的MCODE插件篩選出10個模塊,MCODE算法對每一個識別模塊進行打分排序,節(jié)點數(shù)和分值越高,說明該模塊中蛋白的關(guān)聯(lián)度越高[9]。根皮苷蛋白互作識別模塊如圖2所示。由圖2可知,網(wǎng)絡(luò)模塊1包含節(jié)點數(shù)11,得分11.0;網(wǎng)絡(luò)模塊2包含節(jié)點數(shù)11,得分11.0;網(wǎng)絡(luò)模塊3包含節(jié)點數(shù)9,得分9.0;網(wǎng)絡(luò)模塊4包含節(jié)點數(shù)15,得分7.9;網(wǎng)絡(luò)模塊5包含節(jié)點數(shù)7,得分7.0;網(wǎng)絡(luò)模塊6包含節(jié)點數(shù)6,得分6.0;網(wǎng)絡(luò)模塊7包含節(jié)點數(shù)5,得分5.0;網(wǎng)絡(luò)模塊8包含節(jié)點數(shù)10,得分4.7;網(wǎng)絡(luò)模塊9包含節(jié)點數(shù)11,得分4.0;網(wǎng)絡(luò)模塊10包含節(jié)點數(shù)7,得分4.0,10個模板的得分均在3分以上,說明每個模塊內(nèi)蛋白之間的關(guān)聯(lián)度較高。每個模塊參與的生物過程見表2。

圖2 根皮苷蛋白互作識別模塊Fig.2 The modules of the protein interaction network of phloridzin

表2 功能模塊參與的主要生物過程Table 2 Main biological processes related to the functional module

“模塊性”是蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜系統(tǒng)的一個重要特征,在單個模塊內(nèi)部節(jié)點稠密,而在模塊間節(jié)點稀疏,通過這一特征可以從復(fù)雜系統(tǒng)中挖掘出更多的信息,更好地幫助理解復(fù)雜系統(tǒng)的機能和特性。本研究通過構(gòu)建根皮苷蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并進行模塊分析,對所獲得與降糖相關(guān)的模塊1、模塊4、模塊6、模塊7、模塊8、模塊9、模塊10進行討論。

模塊1與組蛋白乙?；嚓P(guān),組蛋白是染色質(zhì)的核心,其尾部共價修飾在基因表達調(diào)控中起重要作用,研究發(fā)現(xiàn),2型糖尿病外周血單個核細胞(PMBC)組蛋白乙酰化水平增加,組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300和CREBBP基因表達上調(diào),而組蛋白去乙?；窼IRT1下調(diào)[14]。部分1型糖尿病患者外周血單核細胞H4乙?；皆龈?組蛋白修飾參與調(diào)控胰島素基因的表達,胰島素基因啟動子附近區(qū)域組蛋白H3乙酰化水平明顯升高[15]。有學(xué)者將多種低濃度多酚(5 μmol/L)作用于單細胞系統(tǒng),研究不同多酚對于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)的活性影響,結(jié)果表明尿石素B和C(Urolithins B、C)、沒食子酸(Gallic acid)和5-O-沒食子酰基--β-D-葡萄糖(Penta-O-galloyl-β-D-glucose)能夠顯著降低HAT的活性,可以作為表觀遺傳調(diào)節(jié)器[16],根皮苷與文獻中的多酚均存在于蘋果中,且結(jié)構(gòu)功能相似,推測根皮苷具有降低HAT活性的作用。模塊1表明,根皮苷可以通過組蛋白乙酰化作用參與胰島素基因的表達,從分子網(wǎng)絡(luò)水平表明了根皮苷的降糖作用機制。

模塊4與血糖穩(wěn)態(tài)相關(guān),在人體內(nèi)維持血糖穩(wěn)態(tài)可以穩(wěn)定血糖水平、預(yù)防感染,而在呼吸道表面液體(Airway surface liquid,ASL)中維持低葡萄糖濃度是維持人體內(nèi)血糖穩(wěn)態(tài)的重要作用方式。鈉離子偶聯(lián)葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白SGLT1存在于肺部,可有助于清除通過上皮細胞擴散到ASL的葡萄糖[17]。有研究表明,根皮苷可以協(xié)助SGLT1轉(zhuǎn)運除去擴散到ASL的葡萄糖[18]。本研究從分子水平表明,根皮苷通過維持血糖穩(wěn)定發(fā)揮抗糖尿病的作用機制,可通過調(diào)控圖2中鈉離子葡萄糖聯(lián)合轉(zhuǎn)運子家族2/成員2(SLC2A2)和乳糖酶(LCT)等蛋白發(fā)揮降糖作用。

模塊6與乙酰膽堿分解過程相關(guān),乙酰膽堿引起血管舒張反應(yīng),與血管內(nèi)壁的一氧化碳相關(guān),而一氧化碳與糖尿病的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系,糖尿病患者在發(fā)病早期一氧化碳含量明顯降低,這是由于糖尿病患者內(nèi)皮細胞合成一氧化碳減少,造成動脈血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)障礙[19]。多酚類物質(zhì)通過參與乙酰膽堿代謝,起到改善糖尿病患者血管舒張反應(yīng)不全的癥狀,從而保護腎臟、提高記憶力等。有研究表明,辣椒素可以改善2型糖尿病大鼠冠狀動脈內(nèi)皮依賴性舒張不全,同時改善糖尿病慢性高血糖、高血脂狀態(tài)[20];張穎等[21]發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷能增強乙酰膽堿誘導(dǎo)的腎動脈舒張效應(yīng),改善糖尿病腎病大鼠腎動脈舒縮功能。Rizzoni等[22]建立乙酰膽堿、緩激肽、內(nèi)皮獨立血管舒張劑硝普鈉、內(nèi)皮素1濃度-反應(yīng)曲線,發(fā)現(xiàn)非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin-depengent diabetes mellitus,NIDDM)和原發(fā)性高血壓(Essential hypertension,EH)對小動脈形態(tài)學(xué)的影響在數(shù)量上相似,但在質(zhì)量上不同,糖尿病患者中存在的高血壓對小動脈形態(tài)學(xué)的累加作用不大,對內(nèi)皮功能障礙無影響;茶多酚能改善乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張功能,保護腎臟的機構(gòu)和功能[23];白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)乙酰膽堿代謝以及氧化應(yīng)激反應(yīng)提高阿爾茨海默癥合并糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[24]。通過功能模塊分析可知,根皮苷調(diào)節(jié)乙酰膽堿分解,使血管舒張,從而改善高血糖癥狀。

模塊7與戊糖降解過程相關(guān),核糖是人體內(nèi)重要的戊糖,具有加速體內(nèi)胰島素合成、提供能量等作用,有研究[25]表明,糖尿病患者體內(nèi)核糖代謝失常,形成糖基化終末產(chǎn)物(AGEs),該產(chǎn)物能夠加速細胞死亡。Wei等[26]的研究證實,外源攝入核糖可以促進胰島素的產(chǎn)生,暫時降低血糖水平,但這種作用會隨著核糖服用時間的延長而減弱。本研究從分子層面表明根皮苷發(fā)揮降糖作用主要與圖2中模塊7的二氫二醇脫氫酶(Dihydrodiol dehydrogenase,DHDH)、山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase,SORD)、醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH1B1、ALDH3A2)等蛋白相關(guān)。

模塊8、模塊9與嘌呤核苷酸和陰離子轉(zhuǎn)運過程相關(guān),嘌呤核苷酸在能量供應(yīng)、代謝調(diào)節(jié)及組成輔酶等方面起著重要作用,在人體內(nèi)嘌呤氧化后變成尿酸,血尿酸水平升高與2型糖尿病發(fā)生率之間存在正相關(guān)關(guān)系[27]。研究發(fā)現(xiàn),男性體內(nèi)基線尿酸水平高,則發(fā)生糖尿病的風(fēng)險比基線尿酸水平低的男性增加1.78倍[27],不僅如此,高尿酸血癥和2型糖尿病患者腎臟病變、大血管并發(fā)癥、高血壓和其他代謝異常也有非常緊密關(guān)系[28-30]。有機陰離子轉(zhuǎn)運多肽(Organic anion transporting polypeptides,OATPs)多態(tài)性介導(dǎo)口服降糖藥與調(diào)血脂藥物互作是目前研究熱點,OATPs是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運體超家族成員(Super family of solute carders,SLC),在胃腸道、肝腎臟、血腦屏障處均有表達,對藥物吸收、分布、消除有重要影響[31]。本研究從分子層面表明,根皮苷發(fā)揮降糖作用主要與鈉離子耦合核苷酸轉(zhuǎn)運體(Sodium-coupled nucleoside transporter,SLC28A2、SLC28A3)、鋅離子轉(zhuǎn)運體(Zinc transporter,30A4)、胞嘧啶核苷脫氨酶(Cytidine deaminase,CDA)、胸苷磷酸化酶(Thymidine phosphorylase,TYMP)、尿嘧啶-胞嘧啶-激酶(Uridine-cytidine kinase 1,UCKL1)、甘氨酸脒基轉(zhuǎn)移酶(Glycine amidinotransferase,GATM)、雙重氧化酶(Dual oxidase,DUOX1、DUOX2)等蛋白相關(guān)。

模塊10與鈣離子穩(wěn)態(tài)相關(guān),鈣離子穩(wěn)態(tài)在維持細胞器功能和肝臟、脂肪組織關(guān)鍵應(yīng)激反應(yīng)方面起著重要的作用,在機體內(nèi)以磷酸鈣的形式存在,在代謝應(yīng)激、肥胖和糖尿病的影響下,鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變會嚴重影響心臟功能、肌肉收縮、胰島素和血糖素分泌[32]。多酚、多糖、三萜類化合物等通過改善鈣離子穩(wěn)態(tài)改善糖尿病患者的癥狀。有研究發(fā)現(xiàn),靈芝孢子粉能有效改善2型糖尿病大鼠腎臟的鈣離子失衡[33],綠茶多酚對D-半乳糖與Aβ25～35誘導(dǎo)阿爾茨海默癥(Alzheimer)病小鼠鈣穩(wěn)態(tài)有積極的影響[34]。圖2網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果可知,根皮苷通過調(diào)節(jié)白蛋白(Albumin,ALB)、淀粉樣前體蛋白(Amyloid beta(A4)precursor protein,APP)、凝血酶(Thrombin,F2)等蛋白調(diào)節(jié)鈣離子穩(wěn)態(tài)發(fā)揮降糖作用。

3 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫獲得了蘋果中根皮苷的作用靶點,利用STRING獲得靶點的蛋白互作信息,構(gòu)建了根皮苷的蛋白互作網(wǎng)絡(luò),Cytoscape識別網(wǎng)絡(luò)模塊進行聚類分析,利用BinGO 對識別出的模塊參與的生物過程進行了注釋,從分子網(wǎng)絡(luò)水平闡釋了根皮苷降糖作用機制,其主要通過參與組蛋白乙?；?、血糖穩(wěn)態(tài)、乙酰膽堿分解、戊糖降解、嘌呤核苷酸陰離子轉(zhuǎn)運、鈣離子穩(wěn)態(tài)等生物過程發(fā)揮降糖作用。