組學技術(shù)在山羊乳研究中的應用

文/侯艷梅 吳 桐 謝奎詹 智 鈞 陳 瑤 吳 紅 劉曉紅

（海普諾凱營養(yǎng)品有限公司）

山羊乳及其制品（包括液態(tài)山羊乳、發(fā)酵山羊乳、山羊乳奶酪和山羊乳粉）如今已經(jīng)獲得了行業(yè)與市場的廣泛關(guān)注。山羊乳的營養(yǎng)價值主要在于以下幾個方面：（1）同等質(zhì)量的奶源中，山羊乳中的αs1-酪蛋白和β-乳球蛋白含量比牛乳少，因此致敏率低于牛乳；（2）山羊乳酪蛋白在酸化后形成的凝膠與牛乳酪蛋白凝膠相比，強度低且結(jié)構(gòu)疏松，因此消化率更高[1]；（3）山羊乳天然的脂肪球顆粒較小，且中鏈脂肪酸甘油三酯比例較高，消化速率與代謝速率均快速、有效，是很好的能量來源[2]。

有關(guān)山羊乳成分與功能的研究已經(jīng)持續(xù)了上百年，隨著科技的進步，人們對山羊乳成分也有了更深入的了解。

山羊乳中蛋白質(zhì)、糖蛋白、低聚糖、脂質(zhì)等生物分子的結(jié)構(gòu)和功能一直是乳品營養(yǎng)研究的核心。質(zhì)譜技術(shù)的廣泛應用很大程度上擴展了人們對乳制品生物活性物質(zhì)的認識，因為它可以識別、定量和表征乳品中的蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類[3]。近幾年，以質(zhì)譜技術(shù)為基礎發(fā)展起來的組學技術(shù)，例如蛋白質(zhì)組學、糖組學、糖蛋白質(zhì)組學、脂質(zhì)組學等可以對這些生物分子成分進行全面分析。

1蛋白質(zhì)組學

“蛋白質(zhì)組學”在20世紀90年代初首次提出，被定義為系統(tǒng)地分離、鑒定、表征常見來源的蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的生化分析法不同，蛋白質(zhì)組學方法能夠同時、清晰地分析復雜混合物中的全部蛋白質(zhì)。可用于研究不同品種、不同地域山羊乳的高豐度與低豐度蛋白質(zhì)種類，山羊乳在哺乳期和加工過程中蛋白質(zhì)變化以及評估山羊乳品質(zhì)。從廣義上講，蛋白質(zhì)組學結(jié)合了兩種主要技術(shù)：分離和表征。其中分離技術(shù)主要有雙向凝膠電泳（SDSPAGE）、高效液相色譜（HPLC）等；表征技術(shù)包括質(zhì)譜（MS）分析、納米電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（nESI）等[4]。蛋白質(zhì)組學技術(shù)在山羊乳研究中的應用如下。

1．1 區(qū)分山羊乳與其他乳

乳蛋白是極其復雜的混合物，由酪蛋白（αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白，β-酪蛋白，κ-酪蛋白等）和乳清蛋白（α-乳白蛋白，β-乳球蛋白，乳鐵蛋白等）組成。分析不同物種乳蛋白的種類，可以了解乳營養(yǎng)成分的差異。

Eek等[5]利用SDS-PAGE和液相-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)研究了馬來西亞國內(nèi)人乳、牛乳、山羊乳的蛋白質(zhì)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，牛乳和山羊乳中沒有人乳中所含的乳清白蛋白、甘露糖受體、羧酸酯脂肪酶、血清白蛋白等小分子蛋白，這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)更接近母乳的嬰幼兒配方乳粉提供了參考依據(jù)。

Yong等[6]使用蛋白質(zhì)組學方法分析了奶牛乳、牦牛乳、水牛乳、山羊乳和駱駝乳中的乳清蛋白質(zhì)，為鑒定特種乳提供了依據(jù)。該研究表明，二聚糖（一種富含亮氨酸的蛋白多糖）在山羊乳中含量較高，可作為山羊乳的特征蛋白；叢生蛋白（一種高度糖基化的蛋白質(zhì)）可作為水牛乳的特征蛋白；伯胺氧化酶可作為牛乳的特征蛋白（表1）。

表1 不同奶畜乳中豐度較高蛋白質(zhì)種類

1．2 開發(fā)低致敏性乳制品

乳制品過敏癥狀歸因于免疫球蛋白IgE介導的肥大細胞和嗜堿性粒細胞活化以及過敏原特異性T細胞活化，依據(jù)IgE與T細胞識別過敏原的數(shù)據(jù)可知，乳中αs1-酪蛋白是主要的致敏物質(zhì)[7]。Paola等[8]利用SDS-PAGE結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF-MS）證實，山羊乳中的總酪蛋白含量與αs1-酪蛋白的基因型相關(guān)。有關(guān)山羊乳αs1-酪蛋白（αs1-CN）多態(tài)性的研究表明，αs1-酪蛋白的合成水平受不同基因亞型的控制，其中亞型αs1-CNA, αs1-CNB, αs1-CNC屬于強等位基因，亞型αs1-CNE屬于中間等位基因，亞型αs1-CND和αs1-CNF屬于弱等位基因，亞型αs1-CN0屬于無效等位基因。這4類等位基因與山羊乳中αs1-酪蛋白含量的關(guān)系見表2。

由此可知，強等位基因山羊所產(chǎn)的羊乳，其中αs1-酪蛋白含量較其他基因型羊乳高，因此致敏性也相對較高。這一發(fā)現(xiàn)對開發(fā)低敏性羊乳是一個重要啟示，可篩選具有αs1-酪蛋白中間等位基因、弱等位基因或者無效等位基因的山羊為過敏者生產(chǎn)乳制品。

1．3 研究乳蛋白在哺乳期內(nèi)的變化

研究哺乳期內(nèi)乳蛋白成分變化可以提升人們對乳生物學和功能的理解。初乳為新生兒提供營養(yǎng)并增強其免疫力，但隨著初乳向成熟乳轉(zhuǎn)變，乳中的蛋白質(zhì)組分也會發(fā)生復雜的變化[9]。已有研究表明，初乳與成熟乳中的蛋白模式有明顯差異，纖維蛋白原β鏈、幾丁質(zhì)酶3樣蛋白1、α-抗胰蛋白酶、補體C3α鏈、凝溶膠蛋白和載脂蛋白H等小分子蛋白僅能在初乳中被檢測出[10]，而β-酪蛋白片段卻在成熟乳中明顯增加，因此研究哺乳期乳蛋白的變化規(guī)律具有重要意義。

Jing等[11]研究了乳脂肪球膜蛋白在山羊初乳和成熟乳中的差異和作用。結(jié)果表明，在初乳的乳脂肪球膜蛋白中，急性期反應蛋白、參與翻譯和細胞骨架的蛋白等181 種蛋白質(zhì)豐度顯著高于成熟乳，這些蛋白主要來自于細胞質(zhì)、細胞膜以及胞外區(qū)域，具有結(jié)合鳥苷酸，結(jié)合細胞表面和結(jié)構(gòu)分子活動（Structural Molecule Activity）的功能，在生命初期可以保護新生兒。黃嘌呤脫氫酶/氧化酶（XDH）、整合膜蛋白（STOM）和粘蛋白15（MUC15）等8 種乳脂肪球膜蛋白質(zhì)在成熟乳中豐度較高，前兩種有助于泌乳細胞高效持續(xù)的產(chǎn)奶。

表2 不同等位基因與山羊乳中αs1-酪蛋白含量關(guān)系

1．4 評估不同品種山羊乳蛋白的品質(zhì)

山羊乳蛋白質(zhì)組成因山羊品種不同而變化，并可能呈現(xiàn)地域差異。

Whyara等[12]比較分析了來自巴西東北部的Alpine和Saanen兩個品種山羊乳的蛋白質(zhì)組成，并評估其抗菌活性，結(jié)果顯示：兩種山羊乳中均不存在αs1-酪蛋白，并且這兩種山羊乳的αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白的組成也沒有差異，結(jié)論為這兩種山羊均可作為低敏性奶源。兩種山羊乳中乳酪蛋白的蛋白質(zhì)組分（F60%～90%）都可以抑制細菌生長，抑制濃度在50～100 mg/mL之間。

Athanasios等[13]研究了希臘不同品種羊的乳蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，Skopelos山羊乳共有229 個蛋白組，Capra prisca山羊乳共有338 個蛋白組。該研究擴充了山羊乳蛋白數(shù)據(jù)庫，并對山羊飼養(yǎng)提供指導。

1 ．5 探 究 加 工 過 程 對 蛋 白質(zhì)的影響

乳和乳制品在加工儲存過程中發(fā)生的化學變化會影響其品質(zhì)與營養(yǎng)。這些化學變化包括美拉德反應、脂質(zhì)氧化、脂肪分解、蛋白水解和蛋白質(zhì)交聯(lián)。研究最廣泛的是熱處理過程中發(fā)生的美拉德反應，在該反應中，乳糖與賴氨酸ε-氨基上的蛋白質(zhì)結(jié)合，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的乳糖基-賴氨酸，會導致蛋白質(zhì)的消化率以及賴氨酸的生物利用度降低[14]。

Losito等[15]研究了巴氏滅菌乳、UHT滅菌乳和噴霧干燥乳粉中蛋白質(zhì)糖基化程度。結(jié)果表明，乳糖化形式的β-乳球蛋白在上述3 種乳制品種中分別占總β-乳球蛋白的3%、30%和70%。因此，檢測蛋白的糖基化程度，可為后期優(yōu)化生產(chǎn)工藝提供檢驗標準。

1．6 檢測山羊乳摻假

Chen等[16]以β-乳球蛋白作為標記物，利用溶劑分離乳清蛋白，再聯(lián)合高HPLC和電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS），得到了一種用于鑒定山羊乳中是否摻有牛乳的方法，此方法中，當牛乳添加量超過5%即可被檢出。

Nicolao等[17]基于質(zhì)譜和多變量統(tǒng)計分析方法檢測不同混合乳中的牛乳含量，當混合乳中牛乳含量超過2%即可檢出。

2 脂質(zhì)組學

乳制品被認為是富含各種生物活性脂質(zhì)的有機物，脂質(zhì)可分為甘油脂、鞘脂、甘油磷脂、異戊烯脂、糖脂、聚酮化合物、甾醇和脂肪?；鵞18]。

脂質(zhì)組學是研究脂質(zhì)在生命活動中的代謝調(diào)控機制，從系統(tǒng)水平上研究生物體內(nèi)的脂質(zhì)，揭示其相互作用及與其他生物分子作用的新學科[19]。在食品科學領域，脂質(zhì)組學主要應用于分析不同生物資源的脂質(zhì)成分，探討改性反應機理及反應條件的優(yōu)化，監(jiān)控食品質(zhì)量以及評估生物體內(nèi)脂質(zhì)功能和營養(yǎng)水平[20]。

乳脂中的脂肪酸大多以甘油三酯（TAG）的形式存在。了解甘油三酯特征對鑒定乳脂來源和優(yōu)化乳脂成分具有重要意義。通過脂質(zhì)組學技術(shù)，甘油三酯的特征可從同型甘油三酯、脂肪酸組成水平以及脂肪酸位置水平3 個方面進行描述[21]。

2．1通過同型甘油三酯鑒定乳脂類別

同型甘油三酯是指具有相同總碳數(shù)（CN）的一類甘油三酯。依據(jù)同型甘油三酯鑒別乳脂類別是一種有效的方法[22]。

Fontecha等[23]利用氣相色譜（GC）分析了西班牙山羊乳與牛乳的同型甘油三酯。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管山羊乳與牛乳都含有16 種同型甘油三酯（碳原子數(shù)從24～54），但牛乳中C38，C50～C52類同型甘油三酯的相對含量較高，而山羊乳中C40和C42類同型甘油三酯相對含量較高，這些不同類別的同型甘油三酯的相對含量可用于區(qū)分山羊乳脂和牛乳脂。同樣的方法還可有效檢測山羊乳脂中的其他動物脂肪[24]，或者乳脂中的非乳脂肪[25]。

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，越來越多的同型甘油三酯被鑒定出。Fontecha等[26]使用銀離子薄層層析聯(lián)用（Ag+-TLC）和氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)鑒定出了山羊乳中137 種同型甘油三酯。Ruiz-Sala等[27]使用HPLC與GC組合法鑒定出了山羊乳中181 種同型甘油三酯。

2．2 通過脂肪酸組成水平反映乳脂質(zhì)量

分析同型甘油三酯雖然可得出有關(guān)乳脂中甘油三酯的信息（如質(zhì)量分布、總碳數(shù)分布等），但不能揭示每組乳脂中的脂肪酸數(shù)量和種類。研究甘油三酯中脂肪酸的組成不僅可以了解脂質(zhì)的物理性質(zhì)（例如熔點、結(jié)晶性能和流變性質(zhì)）和生理功能，更有助于探究乳腺中甘油三酯分子的合成途徑[20]。

Gantner等[28]回顧了人乳、馬乳、驢乳、水牛乳、奶牛乳、山羊乳和綿山羊乳等7 種乳的乳脂組成。得出結(jié)論，反芻動物乳（水牛、奶牛、山羊、綿羊）和非反芻（馬和驢）動物乳之間存在很大差異。在脂肪酸組成上，非反芻動物的飽和脂肪酸與單不飽和脂肪酸較反芻動物低，但多不飽和脂肪酸含量高，尤其是十八碳二烯酸和十八碳三烯酸，反芻動物與人乳的乳脂中膽固醇含量比較接近。在非反芻動物中，血糖是主要的脂肪酸前體，而在反芻動物中，微生物產(chǎn)生的乙酸和β-羥基丁酸，是C4-C16脂質(zhì)的主要前體[21]。

Qiang等[29]使用超高效液相色譜-四級桿-靜電場軌道阱聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS）分析山羊乳、大豆乳和牛乳中脂質(zhì)的多樣性。結(jié)果表明，豆?jié){富含磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰甘油等磷脂；山羊乳富含中鏈甘油三酯（MCT）、不飽和脂肪酸、ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）含量優(yōu)于豆?jié){和牛乳；牛乳中富含神經(jīng)酰胺、甘油三酯和甘油二酯。

2．3 確定脂肪酸位點，優(yōu)化乳脂結(jié)構(gòu)

脂肪酸在甘油骨架上的位置影響了脂肪酸的消化吸收，飽和脂肪酸（例如棕櫚酸）在sn-2位點時的吸收率會高于在sn-1和sn-3位點。

Cong等[30]利用氣相質(zhì)譜（GC）分析出，人乳中70%～80%的十六烷酸位于sn-2，牛乳中40%的十六烷酸位于sn-2，植物油中5%～20%十六烷酸脂肪酸位于sn-2，而山羊乳中的棕櫚酸有50%位于sn-2。研究脂肪酸在甘油三酯中的位點對于油脂改性和配方乳粉乳脂成分母乳化具有指導意義。

2．4 研究飼養(yǎng)環(huán)境對乳脂的影響

在熱帶、亞熱帶地區(qū)，山羊發(fā)生熱應激對產(chǎn)奶量和乳成分都有潛在影響。

Liu等[31]利用液質(zhì)聯(lián)用（LCMS）方法研究了澳大利亞熱應激效應對牲畜產(chǎn)奶的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熱應激下，乳中甘油三酯和磷脂的質(zhì)譜均會發(fā)生改變，即短鏈和中鏈脂肪酸含量降低，長鏈脂肪酸含量升高；磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿和葡糖神經(jīng)酰胺五種極性脂類的豐度顯著降低。耐熱的牲畜比不耐熱的牲畜所產(chǎn)乳中的溶血磷脂酰膽堿含量高，因此溶血磷脂酰膽堿可作為熱應激生物標志物。

這一研究將為在熱帶、亞熱帶農(nóng)場選育適宜的奶牛、奶山羊以及如何改善飼養(yǎng)環(huán)境提供參考。

3 代謝組學

代謝組學是研究生命體受到內(nèi)外界刺激或基因修飾后所產(chǎn)生的與時間序列相關(guān)聯(lián)的眾多代謝產(chǎn)物的一門學科。作為基因組學和蛋白質(zhì)組學的繼承者，代謝組學將關(guān)注點從基因轉(zhuǎn)移到小分子代謝物，將細胞、組織和生物體整個過程聯(lián)系起來。因此，在代謝物水平上研究生物系統(tǒng)可以更深刻的理解營養(yǎng)學、毒理學、醫(yī)學、生理學和病理學[32]。代謝物與乳成分之間的關(guān)系可以幫助理解乳品的生化特性和加工特性，并且可以突出作為生物標記物的小分子特征。

目前，常見的代謝組學的數(shù)據(jù)采集主要釆用質(zhì)譜（MS）和核磁共振譜（NMR）為核心的分析技術(shù)，再輔助以一些高效的分離設備，共同組合成代謝組學所使用的設備。設備類型包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS或LCMS/MS）、高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用（HPLC-NMR）、高效液相色譜-核磁共振-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-NMR-MS）技術(shù)等。

代謝組學技術(shù)已廣泛應用于人乳和牛乳的研究，但在山羊乳方面還處于初級階段，主要應用于以下幾方面。

3．1 作為山羊乳及其制品標記物

Caboni等[33]利用GC-MS儀器，使用非靶向代謝組學方法研究30只綿羊和28 只山羊奶的代謝物譜。結(jié)果顯示了代謝物譜的差異，綿羊奶中的阿拉伯糖醇、檸檬酸、α-酮戊二酸、甘油酸、肌醇和甘氨酸含量較高，山羊奶含有較高水平的甘露糖-6-磷酸鹽、異麥芽酮糖、纈氨酸、焦谷氨酸、亮氨酸肌醇和巖藻糖。

Paola等[2]通過GC-MS和多變量統(tǒng)計數(shù)據(jù)，研究了市售山羊乳的代謝物庫，并將實驗數(shù)據(jù)與牛乳進行比較。結(jié)果表明，蘋果酸是牛乳的特征代謝物；纈氨酸和甘氨酸是山羊乳的特征代謝物，且纈氨酸味苦，甘氨酸味甜，影響了山羊乳特殊風味。同時，纈氨酸、甘氨酸與亮氨酸、異亮氨酸共同參與支鏈脂肪酸的代謝。

因此，能夠根據(jù)其代謝物譜來區(qū)分奶源類型，以便鑒別山羊乳是否摻其他乳。

3 ．2 作 為 不 同 基 因 型 山 羊乳的標記物

前文提到，山羊乳的αS1-酪蛋白等位基因具有不同亞型，Pierluigi等[34]利用GC-MS和多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)，揭示山羊不同α-酪蛋白基因型中的乳代謝物差異。結(jié)果表明，擁有強等位基因的山羊乳代謝產(chǎn)物為檸檬酸和烏頭酸，對于弱等位基因的山羊，其山羊乳的代謝產(chǎn)物為不同的糖類和多元醇。

3．3 研究不同加工過程對山羊乳的影響

Caboni等[33]通過GC-MS和多變量統(tǒng)計數(shù)據(jù)，分析、研究UHT滅菌和巴氏滅菌熱處理對乳制品代謝物的影響。結(jié)果表明，牛乳和山羊乳經(jīng)過巴氏殺菌后都含有羥基戊二酸，山羊巴氏殺菌乳的特征代謝物為核糖。牛乳UHT滅菌后特征代謝物為葡萄糖和果糖，這是因為牛乳中乳糖含量高于山羊乳，所以在經(jīng)過UHT處理后乳糖被水解成了單糖。

4 小結(jié)

組學技術(shù)可以在全球范圍內(nèi)識別、量化、表征乳中的成分，其的應用改變了乳品科學[3]。不斷發(fā)展的分離方法和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)促使組學技術(shù)更廣泛的應用于鑒別乳品原料的安全性、評估乳制品加工方法的合理性、考察營養(yǎng)素在人體內(nèi)的生物利用率等，以便開發(fā)出更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。