大豆異黃酮對薩能種公羊精液常溫保存效果的影響

文/邵鉞馨 鐘玉玲 李仲陽 史懷平

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院）

薩能奶山羊是世界上優(yōu)秀的奶山羊品種之一，多作為奶山羊品種改良的父本。人們對羊奶需求量的增長，促使我國羊奶產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展。截至2016年底，僅陜西省奶山羊存欄量就達(dá)到220 萬只[1]。隨著選種、選育技術(shù)的不斷發(fā)展，薩能奶山羊的精液品質(zhì)成為配種工作中一項(xiàng)重要指標(biāo)，精液的保存和稀釋在很大程度上影響精液品質(zhì)。近年來，有關(guān)抗氧化劑對凍精保存效果的研究較多?；裘簦?018） 研究表明，在絨山羊精液稀釋液中添加0.5 mg/mL的褪黑素，較對照組的精子活率提高8.5%，頂體完整率提高24.73%[2]。王艷華（2016）研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液中添加1.0 mg/mL的番茄紅素解凍后，精子活率為52.04%，在稀釋液中添加10 μg/mL的α-硫辛酸，精子活率為50.71%，添加抗氧化劑的試驗(yàn)組較對照組能夠顯著提高精液品質(zhì)[3]。

本試驗(yàn)采用的大豆異黃酮從豆科植物中提取，具有抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力作用，其分子結(jié)構(gòu)上含有多個(gè)酚羥基，可以與自由基結(jié)合，達(dá)到消除自由基的功效，已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。研究表明，大豆異黃酮不僅能夠增加動(dòng)物的采食量[4]，對機(jī)體的繁育性能也有積極影響。郭振慧等（2016） 研究表明，在公兔日糧中添加6 mg/kg大豆異黃酮，可以提高公兔抗熱應(yīng)激能力，緩解熱應(yīng)激造成的睪丸損傷[5]。范覺鑫等（2012）研究表明，在香豬日糧中添加250 mg/kg大豆異黃酮能夠促睪丸的生長發(fā)育，睪丸組織中α-葡萄糖苷酶含量較對照組增加137.99 U/L[6]。但目前，在薩能種公羊精液稀釋液中添加大豆異黃酮對精液品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究在種公羊精液稀釋液中外源添加大豆異黃酮對精液常溫保存的影響，為大豆異黃酮在精液保存的實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 試驗(yàn)精液

所用精液來源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜禽生態(tài)試驗(yàn)站薩能羊原種場的成年薩能種公羊。

1．1．2 主要試劑

三羥甲基-氨基甲烷（Tris）、檸檬酸、葡萄糖、果糖、海藻糖、維生素C（Vc）、還原型谷胱甘肽（GSH）、牛血清白蛋白（BSA）、三磷酸腺苷（ATP）、甘油、抗生素。

1．1．3 儀器設(shè)備

分析天平、微量移液器、電磁攪拌器、恒溫箱、高壓滅菌鍋、顯微鏡等。

1．2 試驗(yàn)準(zhǔn)備

1．2．1 稀釋液配方

利用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明專利（常溫稀釋液“奶山羊精液常溫及低溫保存稀釋液”；專利號(hào)碼：ZL201310529785.7），主要成分包括：Tris 300 mmol/L，檸檬酸94.7 mmol/L，果糖30 mmol/L，海藻糖225 mmol/L，Vc 5 g/L，GSH 5 mmol/L，BSA 3 g/L，ATP 1.2 mmol/L，復(fù)合抗生素。

1．2．2 靜液采集

采精一般在早上8:00—10:00進(jìn)行，采精前選擇發(fā)情狀況良好的母羊作為臺(tái)羊，選用假陰道法對試驗(yàn)種公羊進(jìn)行采精，采集后及時(shí)檢測并記錄采精量及精液pH值，然后4 倍稀釋做好標(biāo)簽放入37 ℃保溫杯中，整個(gè)采精過程保證保溫杯水溫穩(wěn)定在37 ℃，采精完成后于30 min內(nèi)將精液帶回實(shí)驗(yàn)室檢測品質(zhì)指標(biāo)。

1．2．3 精液稀釋

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3 組，每組稀釋液中大豆異黃酮濃度分別為0 mmol/L、0.05 mmol/L、0.1 mmol/L。取1 mL稀釋液于5 mL離心管中，置入恒溫水浴鍋至37 ℃，與0.3 mL等溫的鮮精緩慢混勻，用紗布包裹放入17 ℃恒溫箱，每12 h輕輕翻動(dòng)1 次防止精子沉積，每組設(shè)計(jì)5個(gè)重復(fù)。

1．3 精液保存效果檢測

1．3．1 有效存活時(shí)間

精液保存在17 ℃恒溫箱中，每12 h檢測1 次活力指標(biāo)，當(dāng)精子活率低于0.6時(shí)默認(rèn)為輸精效果較差，記錄精子活率低于0.6的保存時(shí)間。

1．3．2 精子活率

精子活率的測定參照胡傳水[7]對豬精液的計(jì)數(shù)方法。

1．3．3 精子質(zhì)膜和頂體完整性

質(zhì)膜完整性：使用試劑盒進(jìn)行低滲腫脹試驗(yàn)（Hypoosmotic Swelling Test，HOST），質(zhì)膜完整的精子會(huì)吸水膨脹產(chǎn)生彎尾現(xiàn)象，質(zhì)膜不完整的精子形態(tài)不會(huì)發(fā)生變化，400 倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)彎尾率，計(jì)數(shù)至少200 個(gè)精子，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

頂體完整性：依照精子快速染色試劑盒方法，制作涂片并完成染色，置于油鏡下觀察，頂體完整的精子可以觀察到明顯的透明帶結(jié)構(gòu)，計(jì)數(shù)至少200 個(gè)精子，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1．3．4 精子T-AOC、MDA、ROS水平檢測

總抗氧化能力（T-AOC）、氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量采用購自南京建成生物工程研究所的檢測試劑盒進(jìn)行測定。

1．4 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 5.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最終試驗(yàn)結(jié)果表示為“平均數(shù)（x）±標(biāo)準(zhǔn)差（s）”。

圖 1 大豆異黃酮濃度對成年公羊精子有效存活時(shí)間的影響

2 結(jié)果與分析

2．1 大豆異黃酮對精液常溫保存效果的影響

由圖1可知，基礎(chǔ)稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.05 mmol/L時(shí)，精子有效存活時(shí)間為（31.42±2.97）h，較對照組存活時(shí)間增加12.89 %，但差異不顯著（P＞0.05）?；A(chǔ)稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.10 mmol/L時(shí)，精子有效存活時(shí)間為（30.6±4.29）h，與0.05 mmol/L大豆異黃酮組和對照組差異不顯著（P＞0.05）。

表 1 在常溫保存條件下添加大豆異黃酮對成年公羊精子活率的影響

表 2 常溫保存條件下添加大豆異黃酮對成年公羊精子結(jié)構(gòu)完整性的影響

2．2 大豆異黃酮對精子活率的影響

由表1可知，試驗(yàn)組與對照組在精子保存前2 天時(shí)，精子活率差異不顯著（P＞0.05）。精子保存第3～4天時(shí)，0.05 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率與對照組和0.10 mmol/L大豆異黃酮差異不顯著（P＞0.05）；0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率與對照組差異性顯著（P＜0.05）。在第5天，大豆異黃酮組的精子活率均顯著高于對照組（P＜0.05）。

2．3 大豆異黃酮對精子結(jié)構(gòu)完整性的影響

由表2可知，精液保存第3天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的質(zhì)膜完整性顯著高于對照組，提高了2.51 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）；在第4天后，試驗(yàn)組的質(zhì)膜完整性均顯著高于對照組，0.10 mmol/L大豆異黃酮組提高了3.29 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）。精液保存期間，大豆異黃酮組的頂體完整性與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

2．4 大豆異黃酮對精液抗氧化指標(biāo)的影響

精液放于17 ℃恒溫箱的第3天，檢測精液的抗氧化指標(biāo)。隨著大豆異黃酮濃度的增加，精液的抗氧化能力增強(qiáng)。由圖2可知，大豆異黃酮組T-AOC水平顯著高于對照組（P＜0.05）。精液中MDA水平與大豆異黃酮濃度成反比，各組間MDA水平差異顯著，0.10 mmol/L大豆異黃酮組低于0.05 mmol/L大豆異黃酮組，0.05 mmol/L大豆異黃酮組低于對照組（P＜0.05）。大豆異黃酮組ROS水平顯著低于對照組，但2 個(gè)大豆異黃酮組間差異性不顯著（P＞0.05）。

3 討論

精子在常溫環(huán)境下活動(dòng)性強(qiáng)，易產(chǎn)生氧化損傷。因此，外源添加抗氧化劑成為精液稀釋液保存的研發(fā)重點(diǎn)。研究表明，多種不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)位于精子質(zhì)膜上，質(zhì)膜完整性在精子獲能及頂體反應(yīng)中有重要作用。精子頂體內(nèi)膜存在大量頂體酶原，酶原能夠促使精卵結(jié)合，頂體的完整性決定了進(jìn)行精卵結(jié)合的能力。同時(shí)，延長精液常溫保存時(shí)間為跨區(qū)域引種提供保障，提高精液在人工授精過程中的有效利用率。大豆異黃酮是一種植物性雌激素，高劑量添加于稀釋液中不易溶解，導(dǎo)致關(guān)于其對精液保存效果報(bào)道較少，降低了大豆異黃酮在動(dòng)物保種工作中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)在精液稀釋液中添加不同濃度的大豆異黃酮，分析精液常規(guī)指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其能夠降低精液在常溫保存過程中所受的損傷，改善精液品質(zhì)。

圖 2 大豆異黃酮對成年奶山羊精液抗氧化水平的影響

3．1 大豆異黃酮對精液常溫常規(guī)指標(biāo)的影響

目前，關(guān)于抗氧化劑對家畜精液保存影響的報(bào)道不一。劉琦等（2015）在常溫保存基礎(chǔ)稀釋液中添加不同體積的GSH，每隔24 h觀察精子活力，結(jié)果表明1 mmol/L和5 mmol/L GSH常溫有效存活時(shí)間達(dá)到5 天，顯著高于對照組保存時(shí)間[8]。何錦等（2015）在豬精液常溫保存稀釋液添加10 mol/L五味子乙素，精液在第5天仍可進(jìn)行人工輸精要求[9]。徐文慧等（2017）探究抗氧化劑對馬精液低溫保存效果發(fā)現(xiàn)，添加?；撬崂鋬霰４? 天后，精子活率為78%[10]。任子利等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，外源添加5.0 g/L維生素C試驗(yàn)組與對照組藏豬精子畸形率差異性顯著，畸形率降低10 %，精子活率為69%[11]。有研究表明，不同稀釋液對種公羊精液保存時(shí)間有差異[12]。本試驗(yàn)在羊精液稀釋液中添加大豆異黃酮至濃度為0.05 mmol/L、0.10 mmol/L時(shí)，試驗(yàn)組的精液保存時(shí)間均高于對照組，但組間差異不顯著。試驗(yàn)第2天，精子活率低于0.6，但0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率下降趨勢平緩。精液保存至第3～4天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的精子活率顯著高于對照組，說明大豆異黃酮對精子活率有保護(hù)作用，能夠有效緩解精子在常溫保存過程中活率下降的現(xiàn)象。與其他試驗(yàn)結(jié)果不同的是，薩能奶山羊精液存活時(shí)間明顯較短，分析原因可能是：其一，試驗(yàn)動(dòng)物不同，羊的精子遺傳特性與生理學(xué)特征可能有其特殊性；其二，抗氧化劑不同，大豆異黃酮不同于其它抗氧化劑，可能對精液抗氧化效果影響小，而且有可能存在奶山羊精液對大豆異黃酮不敏感的因素。此外，還可能與添加大豆異黃酮的濃度有關(guān)，在后續(xù)試驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)行0.25 mmol/L、0.50 mmol/L水平對精液的影響。

精液在保存過程中，會(huì)受到溫度、pH值、滲透壓等影響，造成精子結(jié)構(gòu)完整性被破壞。毛冉等（2016） 研究發(fā)現(xiàn)，每100 mL杜泊羊精液稀釋液中添加5 mL卵黃保存，與對照組的頂體完整性和質(zhì)膜完整性相比差異性顯著，隨著卵黃添加量的增多，保存效果越明顯，保存72 h時(shí)檢測發(fā)現(xiàn)，添加15 mL卵黃的稀釋液可使精子質(zhì)膜完整性達(dá)到35%以上，頂體完整性達(dá)到68.3%左右[13]。李方舟等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在稀釋液添加20 mg/L褪黑素對薩?？斯蚓旱蜏乇４?，第3 天時(shí)質(zhì)膜完整率高出對照組5.98%，頂體完整率比對照組高4.15%[14]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，精液保存第3天時(shí)，0.10 mmol/L大豆異黃酮組比對照組的質(zhì)膜完整性高出2.51%。雖然試驗(yàn)結(jié)果顯示，頂體完整性與對照組差異性不顯著，但是可以看出在稀釋液中添加大豆異黃酮對精子結(jié)構(gòu)完整性有促進(jìn)效果。

3．2 大豆異黃酮對精液抗氧化指標(biāo)的影響

精液中T-AOC水平高低，能夠反應(yīng)抗氧化劑結(jié)合活化氧自由基能力；MDA水平是脂質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)[15]；ROS的水平代表活化氧的含量，其產(chǎn)生過程復(fù)雜，ROS含量的增多會(huì)破壞機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)。本試驗(yàn)中，0.10 mmol/L大豆異黃酮組的T-AOC水平顯著增強(qiáng)，其余氧化指標(biāo)與對照組差異性顯著，0.10 mmol/L大豆異黃酮組與對照組相比，精液的T-AOC水平提高48.25%、MDA水平下降47.93%。Naijian等（2013）試驗(yàn)表明，添加1 mmol/L抗氧化丁基甲苯不能影響精子頂體完整性，但能極顯著降低MDA水平，改善山羊精子活率[16]。Khalifa等（2010）研究證明，添加0.6 mmol/L抗氧化丁基甲苯能夠維持解凍后50%左右的精子活率和較高的繁殖率[17]。Li等（2017）研究表明，保存杜洛克公豬精液時(shí)，添加5 mmol/L?；撬崮軌蚓S持T-AOC水平，降低脂質(zhì)過氧化物水平，延長精液保存時(shí)間[18]。這與本試驗(yàn)獲得的精液保存效果類似，精液在保存過程中抗氧化能力降低，外源添加適量大豆異黃酮能夠增強(qiáng)精子抗氧化酶活性，從而提升T-AOC水平，降低MDA和ROS水平，達(dá)到精液長時(shí)間保存的效果。

4 結(jié)論

在薩能種公羊精液常溫保存過程中，稀釋液中添加大豆異黃酮濃度至0.10 mmol/L時(shí)，可有效提高精子活率，保護(hù)精子結(jié)構(gòu)完整性，而且可顯著提高精液抗氧化水平，對精液常溫保存具有一定的積極作用。