原花青素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞功能及miR-221表達的影響

鄒燕，吳斐，季昳弛，何雪梅，周翔宇

原花青素(procyanidine，PC)是一類廣泛存在于自然界的黃烷-3-醇類化合物，具有抗氧化活性、抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、保護血管內(nèi)皮細胞、抗癌、降血壓、降血脂、降血糖等生物活性[1-2]，血管內(nèi)皮的功能狀態(tài)與這些疾病的發(fā)生發(fā)展及預后都有一定的關系。有研究表明PC可影響內(nèi)皮細胞的功能，抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管新生[3-4]，也有部分研究報道PC可以促進內(nèi)皮細胞的增殖和血管新生[5-6]。目前PC的作用機制尚不清楚，其對內(nèi)皮細胞功能的影響仍須進一步驗證。

microRNA(miRNA)是一類非編碼小RNA，可通過調(diào)控基因表達從而影響細胞的增殖、凋亡、分化、遷移、表型轉(zhuǎn)換等各種生理過程[7-9]。miR-221在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10]，miR-221可以調(diào)節(jié)高糖誘導的內(nèi)皮功能受損、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞NO的釋放和炎性反應[11-13]。近期研究表明PC可通過調(diào)節(jié)microRNA的表達發(fā)揮調(diào)控細胞脂肪形成、抗癌細胞等生物活性[14-16]，但目前PC影響HUVECs的功能是否與miR-221表達變化相關未見報道。本研究觀察PC對HUVECs增殖和遷移的影響，并進一步探討PC對內(nèi)皮細胞中miR-221表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、主要試劑 PC購自美國Sigma公司，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)購自美國Science Cell公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，DMEM低糖培養(yǎng)基為美國HyClone公司產(chǎn)品，CCK-8試劑購自碧云天公司，RNA提取試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒、micro RNA上下游引物均購自天根生化有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PC溶液的配制及細胞培養(yǎng) 500mg PC粉劑溶于5ml無菌注射用水中使其濃度為100mg/ml，置于–20℃避光保存?zhèn)溆?。將HUVECs培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。將實驗分為對照組及5、25、50、75、100μg/ml PC組，其中對照組不經(jīng)PC處理，PC組分別予以5、25、50、75、100μg/ml PC處理24h。

1.2.2 CCK-8細胞增殖實驗 待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度為2×103/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待細胞貼壁生長良好時，吸棄原培養(yǎng)液，分別加入終濃度為0(對照)、5、25、50、75、100μg/ml PC的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，每組5個復孔。然后每孔加入5g/L的CCK-8溶液10μl繼續(xù)培養(yǎng)1h。在酶標儀上檢測450nm處的吸光度(OD)值。每組平均5個復孔，重復3次。

1.2.3 細胞劃痕實驗 在CCK-8實驗中，50μg/ml PC能明顯抑制HUVECs增殖活性，且不會表現(xiàn)出明顯藥理學毒性，故后續(xù)實驗均選擇50μg/ml PC進行。待細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，調(diào)整細胞密度為2×105/ml，每孔2ml接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待細胞間形成較緊密連接的單層，用200μl槍頭垂直于背后的橫線進行劃痕。用PBS洗掉漂浮細胞后分別換以終濃度為0(對照)、50μg/ml PC溶液的2% 胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、6、24h時在倒置相差顯微鏡下觀察并拍照，選擇5個不同視野分別觀察劃痕創(chuàng)面愈合情況。采用Image J軟件測定劃痕面積，劃痕愈合率=(0h的劃痕面積－6h或24h的劃痕面積)/0h的劃痕面積×100%。實驗重復3次。

1.2.4 熒光定量PCR檢測 實驗設為對照組和PC 50μg/ml組，分別予以含0、50μg/ml PC的完全培養(yǎng)基處理24h，再用細胞總RNA提取試劑盒提取HUVECs的總RNA，并測定RNA的濃度及完整性，質(zhì)量檢測合格后進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6作為參照，再按說明書進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應。反應條件如下：95℃預變性15min；94℃20s、60℃ 34s，35個循環(huán)。最后通過解鏈曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性，每個樣本設置3個復孔，實驗重復3次。microRNA的相對表達量用2–ΔΔCt表示，其中?Ct=Ct目標微小RNA－CtU6，??Ct=?Ct處理－?Ct對照。

1.2.5 miR-221的靶基因預測及GO分析、KEGG Pathway分析 在miRWalk數(shù)據(jù)庫(http∶//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/index.html)中預測miR-221的靶基因，取Target Scan、mi Randa、miRDB、miRWalk中的靶基因的交集作為預測的靶基因。在DAVID數(shù)據(jù)庫(https∶//david.ncifcrf.gov/)里進行miR-221預測靶基因的GO分析和KEGG Pathway分析，找出與細胞增殖、遷移相關的靶基因和信號通路。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以表示，CCK-8實驗中各組OD值比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；對劃痕實驗和熒光定量PCR檢測數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)　果

2.1 PC對HUVECs增殖活性的影響 在正常培養(yǎng)的條件下，不同濃度PC處理HUVECs 24h，5μg/ml PC對HUVECs的增殖活性影響不大(P＞0.05)，而25、50、75、100μg/ml PC呈濃度依賴性抑制HUVECs的增殖活性(P＜0.01，圖1)。雖然25μg/mlPC組能抑制細胞增殖，但是50μg/ml PC組抑制HUVECs增殖活性更強，而75μg/ml PC組和100μg/ml PC組又呈現(xiàn)過強抑制細胞增殖的作用，故后續(xù)實驗選擇了能呈現(xiàn)出一定抑制細胞增殖作用又不呈現(xiàn)明顯藥理學毒性的50μg/ml濃度PC進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度的 PC對HUVECs增殖的影響(n=5)Fig.1 Effects of different concentrations of PC on the proliferation of HUVECs (n=5)

2.2 PC對HUVECs遷移能力的影響 HUVECs劃痕實驗結(jié)果提示，劃痕6h后，50μg/ml PC組的劃痕愈合率(7.85%±0.58%)明顯低于對照組(29.71%±2.06%)，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0005)；劃痕24h后，50μg/ml PC組的劃痕愈合率(21.10%±0.84%)明顯低于對照組(83.60%±4.50%)，差異仍有統(tǒng)計學意義(P=0.0002，圖2)。

圖2 劃痕實驗檢測PC對HUVECs遷移能力的影響Fig.2 Scratching pictures of HUNECs of control group and 50μg/ml PC group at 0, 6, 24h time point PC. Procyanidine

2.3 miR-221的表達變化 熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，U6和miR-221的熔解曲線均為單峰，產(chǎn)物單一，顯示引物特異性比較好，無非特異性擴增和引物二聚體干擾(圖3)。對照組miR-221的相對表達水平(1.099±0.170)明顯低于50μg/ml PC組(3.261±0.205)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.0001)。

2.4 miR-221靶基因的預測 在miRWalk數(shù)據(jù)庫中預測has-miR-221的靶基因，取Target Scan、miRanda、miRDB、miRWalk中靶基因的交集作為預測的靶基因，共203個。將這些靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO分析和KEGG Pathway分析，結(jié)果顯示，與細胞增殖有關的靶基因有ADAM17、KIT、ST8SIA1、CDKN1B、EFNB2、EIF5A2、GDF9、HIPK1、KDR、NTF3、PDGFD(圖4)；與細胞遷移有關的靶基因有ADAM17、KIT、CYR61、KDR、NTF3、PIK3R1、PDGFD、SEMA3C、SEMA6D(圖5)。KEGG pathway分析結(jié)果如圖6，靶基因富集FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、癌癥膽堿能代謝信號通路(Choline metabolism in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、煙癮信號通路(Nicotine addiction)、逆行內(nèi)源性大麻素信號通路(Retrograde endocannabinoid signaling)5條信號通路。

3 討　論

近年來，天然植物類藥物(比如PC、白藜蘆醇等)因為其毒副作用小、來源廣泛等眾多優(yōu)點被廣泛用于新藥的基礎及臨床研究中。PC的抗氧化活性、防治心血管疾病、抗腫瘤、抑制血管新生等生物學活性已被證實。在內(nèi)皮細胞的功能方面，近期的研究表明PC可以影響內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管新生：Kumar等[4]報道20～40μg/ml原花青素B2-3,3"-二-氧-沒食子酸酯(B2G2)可通過調(diào)節(jié)血管

內(nèi)皮生長因子受體2/磷脂酰肌醇3激酶/蘇氨酸激酶通路(VEGFR2/PI3K/Akt通路)和整合素信號轉(zhuǎn)導通路抑制內(nèi)皮細胞生長、運動和血管新生，而在10μg/ml的濃度下對內(nèi)皮的功能無明顯影響；也有學者Garcia-Conesa等[3]報道PC在10μg/ml濃度下可抑制HUVECs遷移并調(diào)節(jié)具有血栓形成型1基序的金屬肽酶(ADAMTS1)、凝血酶敏感蛋白1(THBS1)、內(nèi)皮素-1(ET-1)等遷移增殖相關基因的表達。但馬麗等[6]報道PC在10～100μg/ml的濃度下可促進HUVECs增殖，而在200～800μg/ml的濃度下則抑制內(nèi)皮細胞增殖；Liu等[5]報道PC可能通過減輕高糖條件下對內(nèi)皮祖細胞的氧化損傷，上調(diào)VEGFR-2的表達及其下游信號通路，促進細胞增殖和管形成。而本研究發(fā)現(xiàn)5～100μg/ml PC培養(yǎng)HUVECs 24h后，5μg/ml PC對HUVECs的增殖影響不大，25、50、75、100μg/ml的PC呈濃度依賴性抑制HUVECs的增殖，在不呈現(xiàn)明顯藥理學毒性的條件下，50μg/ml PC可明顯抑制HUVECs增殖(P＜0.01)；在劃痕實驗中，50μg/ml PC在劃痕后6h和24h均能明顯抑制HUVECs的遷移(P＜0.01)。PC對內(nèi)皮細胞功能的不一致性可能是因為PC是一類由黃烷-3-醇如兒茶素和表兒茶素等的寡聚或多聚物組成的混合物，而各研究中使用的PC寡聚或多聚物含量組成或結(jié)構(gòu)式并未一致，可能在低濃度時或者某些結(jié)構(gòu)式的條件下可以促進內(nèi)皮細胞增殖和遷移，而在高濃度或另一種結(jié)構(gòu)式的條件下則抑制內(nèi)皮增殖和遷移，但其具體作用機制有待進一步研究。

圖3 U6和miR-221的熔解曲線Fig.3 The melting curves of U6 and miR-221 A. U6; B. miR-221

圖4 與細胞增殖相關的hsa-miR-221靶基因的GO分析Fig.4 GO analysis of hsa-miR-221 target gene related to cell proliferation

圖5 與細胞遷移相關的hsa-miR-221靶基因的GO分析Fig.5 GO analysis of hsa-miR-221 target gene related to cell migration

圖6 hsa-miR-221的靶基因KEGG信號通路分析結(jié)果Fig.6 KEGG pathway analysis of hsa-miR-221 target genes

PC可以調(diào)節(jié)miRNA的表達變化從而控制細胞的功能，Zhang等[14]報道PC可調(diào)節(jié)3T3-L1細胞miR-483-5p的表達從而抑制脂肪形成，Mao等[15]報道葡萄籽PC抗肺癌的機制與microRNA-19a/b調(diào)節(jié)有關，Castell-Auví等[16]還發(fā)現(xiàn)PC可以通過改變miRNA的表達模式發(fā)揮其對胰島的生物活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)50μg/ml PC處理HUVECs 24h后會促進miR-221的表達(P＜0.01)。miRNA-221與血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、凋亡等功能密切相關，且已有研究發(fā)現(xiàn)miR-221可抑制內(nèi)皮細胞的遷移、黏附、小管形成[17-20]。Zhang等[21]的研究結(jié)果顯示，在內(nèi)皮祖細胞(EPC)中，miR-221可通過調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶靶向抑制EPC的增殖。另外，miR-221還可以保護內(nèi)皮細胞、調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)的釋放和炎性反應[11-13]。本研究發(fā)現(xiàn)PC可以抑制HUVECs的增殖和遷移(P＜0.01)并且可以上調(diào)HUVECs的miR-221表達(P＜0.01)，故推測PC抑制HUVECs增殖和遷移可能與調(diào)節(jié)miR-221的表達有關。進一步通過miR-221靶基因分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)其靶基因主要與細胞增殖、遷移等功能有關，KEGG Pathway分析得出其靶基因富集FoxO信號通路、癌癥膽堿能代謝信號通路、PI3KAkt信號通路、煙癮信號通路、逆行內(nèi)源性大麻素信號通路5條信號通路，分析發(fā)現(xiàn)FoxO信號通路涉及miR-221靶基因BCL2L11、ATG12、CDKN1B、NLK、PIK3R1、SOD2調(diào)控細胞周期、凋亡、自噬、氧化應激和DNA修復，癌癥膽堿能代謝信號通路通路涉及miR-221靶基因FOS、LYPLA1、PIK3R1、PDGFD、SLC22A3調(diào)控甘油磷脂代謝，PI3K-Akt信號通路涉及miR-221靶基因BCL2L11、KIT、CDKN1B、KDR、PIK3R1、PDGFD、THBS2、YWHAG調(diào)控細胞周期、細胞活力，煙癮信號通路涉及miR-221靶基因GABRG1、GABRG2、SLC17A8調(diào)節(jié)突觸傳遞，逆行內(nèi)源性大麻素信號通路涉及miR-221靶基因GABRG1、GABRG2、ITPR2、SLC17A8調(diào)節(jié)細胞去極化抑制和鈣離子釋放，其中FoxO信號通路和PI3K-Akt信號通路通過miR-221靶基因參與調(diào)控細胞周期、細胞活力、細胞凋亡，因此我們推測PC可能是通過上調(diào)miR-221的表達調(diào)節(jié)FoxO信號通路和PI3K-Akt信號通路來抑制HUVECs的增殖和遷移，其分子機制仍有待進一步驗證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PC可抑制HUVECs增殖及遷移并上調(diào)miR-221的表達，通過miR-221的靶基因分析推測PC抑制HUVECs增殖及遷移的機制可能涉及PIK3R1、BCL2L11、ADAM17、KIT等靶基因和FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路。這為今后PC的基礎研究、臨床研究及應用提供了理論依據(jù)。

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