基于高通量測序鑒定慈姑黃化病病原

張馳 胡成慧 邱靜思 蘇燕 鄒承武

摘要：【目的】明確引致廣西平樂縣慈姑大面積黃化的主要病原物，為該病害的防治提供參考?！痉椒ā繌膹V西平樂縣采集自然表現(xiàn)褪綠黃化癥狀的慈姑植株，分別提取其葉片和莖組織的總RNA，利用RNA-Seq高通量測序技術(shù)對其轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，并對序列組裝獲得的重疊群（contigs）進(jìn)行BLAST注釋，篩選出注釋為植原體16S rRNA序列的contigs，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物Phy-F和Phy-R，以采集的褪綠黃化癥狀慈姑植株和無癥狀植株的葉片樣本總DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定?！窘Y(jié)果】對擴(kuò)增獲得的長度為1.5 kb的DNA片段進(jìn)行序列測定，從分子水平證實(shí)慈姑黃化病的病原為植原體（strain：AY-China）。將測序獲得的植原體16S rRNA序列與GenBank收錄的15個(gè)植原體分組代表菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)AY-China與翠菊黃化植原體16SrI組（Aster yellows group：16SrI）聚類在同一分支，且各組代表菌株的16S rRNA序列相似性在88.3%～96.0%。進(jìn)一步將AY-China與16SrI不同亞組代表菌株的16S rRNA序列進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)AY-China與翠菊黃化植原體16SrI-B亞組聚類到在一分支，且與16SrI-B亞組代表菌株的16S rRNA序列相似性高達(dá)99.5%，說明AY-China應(yīng)屬于16SrI-B亞組?！窘Y(jié)論】廣西平樂縣慈姑黃化病病原為植原體，其隸屬于翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。

關(guān)鍵詞： 慈姑黃化病;高通量測序;植原體;16S rRNA序列;系統(tǒng)進(jìn)化分析

中圖分類號： S436.45;S432.44? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0578-07

0 引言

【研究意義】慈姑（Sagittaria sagittifolia L.）隸屬于澤瀉科慈姑屬，為多年生水生草本植物，其球莖可食用或制作淀粉，亦可入藥（王漢榮等，2009）。近年來，隨著慈姑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，慈姑病害問題不斷出現(xiàn)。據(jù)報(bào)道，目前慈姑病害主要有黑粉病、葉斑病、褐斑病、斑紋病、軟腐病、葉柄基腐病、鏈孢霉紅粉病和粘菌病等（陳建明等，2016）。2017年在廣西平樂縣大面積發(fā)生一種慈姑黃化病，噴施多種殺真菌和殺細(xì)菌藥劑進(jìn)行防治均無效果，根據(jù)其葉片出現(xiàn)黃化和斑駁癥狀，初步推測其感染病毒或植原體，但目前國內(nèi)外尚無病毒或植原體引致慈姑植株黃化的報(bào)道，無確切的病原物序列信息可供參考。因此，利用新技術(shù)對慈姑未知病原物進(jìn)行鑒定，對于制定有針對性的防治方案具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】測序法是鑒定病原物最準(zhǔn)確的方法之一，將植物病害樣本的高通量測序數(shù)據(jù)與現(xiàn)有的微生物基因信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，可迅速鑒定出各類病原微生物。自2009年高通量測序技術(shù)應(yīng)用于新病毒檢測以來，該技術(shù)在快速鑒定病原物，特別是未知病原物方面展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢（Saldarelli et al.，2017）。迄今，應(yīng)用高通量測序技術(shù)已成功鑒定了上百種新的植物病毒和類病毒（馬宇欣和李世訪，2016）。Rosario等（2014）通過粉虱的RNA病毒元基因組測序發(fā)現(xiàn)并鑒定了由粉虱傳播的香石竹潛隱病毒屬病毒（Carlavirus）;Mardi等（2015）對酸橙鬼帚病樣本和健康的酸橙樣本分別進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，在酸橙鬼帚病樣本中鑒定到植原體的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)2805個(gè)差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs），其中上調(diào)的DEGs主要富集在細(xì)胞壁合成與降解途徑、激素生物合成途徑、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蔗糖代謝途徑、次生物質(zhì)代謝途徑、氨基酸和脂類代謝途徑等，而下調(diào)的DEGs主要富集在泛素蛋白水解和氧化磷酸化途徑;Su等（2015）應(yīng)用小RNA深度測序技術(shù)鑒定了檸檬樹上的啤酒花矮化病毒;辛敏（2017）對采自河南省開封市西瓜田呈現(xiàn)典型病毒病癥狀的樣品進(jìn)行高通量測序，通過序列拼接和比對，鑒定出5種已知的西瓜病毒和3種未知RNA病毒;王慧煜等（2018）利用高通量測序技術(shù)對來源于不同邊境地區(qū)的蜱類進(jìn)行宏基因組測序，并對其所攜帶的病原基因序列進(jìn)行鑒定和分類;Rott等（2018）利用高通量測序技術(shù)對蘋果軟枝病的病原進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)蘋果軟枝病毒ARWV-1和ARWV-2?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)外對慈姑病毒和植原體的研究極少，單憑慈姑黃化癥狀無法確定其病原是病毒還是植原體。由于高通量測序技術(shù)用于鑒定病原物可不依賴病原物序列信息，因此本研究擬利用該技術(shù)對慈姑黃化病的樣品進(jìn)行高通量測序，以期獲得其病原物的序列信息，從而鑒定該病害的病原物?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺對慈姑黃化癥狀樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，并對組裝獲得的單基因簇（unigene）進(jìn)行注釋，根據(jù)注釋信息篩選出病原物信息，以明確引致廣西平樂縣慈姑大面積黃化的主要病原物，為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料：自然表現(xiàn)褪綠黃化癥狀的慈姑植株和無癥狀慈姑植株均采自廣西桂林市平樂縣。主要試劑：植物DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;2×ES Taq Master Mix（含染料）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;瓊脂糖BIOWEST? Regular Agarose G-10購自Biowest公司;GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder購自Thermo公司;克隆載體pMD18-T和TRIzol試劑購自寶生物工程（大連）股份有限公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 慈姑黃化病病原體檢測 取褪綠黃化癥狀的慈姑葉片和莖組織各0.1 g，分別用TRIzol法提取總RNA，經(jīng)質(zhì)檢符合RNA-Seq要求后，將兩個(gè)樣品的總RNA各取1.0 μg混合后進(jìn)行RNA-Seq建庫，利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺進(jìn)行深度測序，然后對去除接頭（adapter）和低質(zhì)量讀段（reads）的有效讀段（clean reads）進(jìn)行組裝獲得unigene，分別將unigene在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST注釋，再通過分析注釋信息篩選疑似病原體的核酸序列信息。根據(jù)RNA-Seq測序獲得的病原體序列信息設(shè)計(jì)引物，對自然表現(xiàn)褪綠黃化癥狀的慈姑樣品和無癥狀慈姑樣品進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL，2×ES Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/L的正、反向引物各1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min;12 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，使用Syngene G：Box凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）進(jìn)行拍照。

1. 2. 2 PCR產(chǎn)物亞克隆與序列分析 PCR產(chǎn)物切膠回收后與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后從藍(lán)白篩選培養(yǎng)基上挑取白色的單菌落進(jìn)行PCR鑒定以獲得陽性克隆，再對陽性克隆進(jìn)行序列測定。使用MEGA 6.0中的ClustalW算法，將測得的慈姑植原體16S rRNA序列與GenBank上下載的15個(gè)植原體分組（I～XV）代表菌株的16S rRNA序列進(jìn)行多重序列比對，去除兩端未對齊的序列，使用最大似然法（Maximum likelihood，ML），參數(shù)默認(rèn)，自助值檢驗(yàn)1000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。使用DNASTAR Lasergene v7.1的MegAlign模塊進(jìn)行序列相似性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 慈姑黃化病病株癥狀表現(xiàn)

感病慈姑植株葉片自頂端和邊緣開始表現(xiàn)黃化癥狀，首先是葉緣和葉脈發(fā)黃，然后葉脈間的葉肉逐漸黃化，嚴(yán)重時(shí)整株黃化枯死。

2. 2 高通量測序分析結(jié)果

利用Illumina HiSeqTM 4000高通量測序平臺對采集的慈姑黃化病樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測序，并對組裝獲得的unigene進(jìn)行基因功能注釋，然后對所有注釋的unigene數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有59.66%（62696條）的unigene得到注釋。對注釋信息進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)存在8條豐度較高的植原體基因序列，其中植原體16S rRNA序列的覆蓋度最高（76.22倍），未發(fā)現(xiàn)病毒序列信息（表1）。

2. 3 PCR鑒定及序列分析結(jié)果

根據(jù)獲得的植原體16S rRNA序列信息設(shè)計(jì)并合成引物（Phy-F： 5'-CCCAATACGAAGAGTTTGAT CCT-3'和Phy-R： 5'-GGATACCTTGTTACGACTTAAC C-3'，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為1504 bp），經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)植原體檢測引物在所采集的慈姑黃化病DNA樣品中均能擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符的特異性目的片段，而在無癥狀樣品中未擴(kuò)增出目的片段。對擴(kuò)增獲得的特異性目的片段進(jìn)行克隆及序列測定，序列相似性分析結(jié)果表明，該株系與植原體16SrI組中各植原體的核苷酸序列相似性均在98.6%以上，其中與翠菊黃化植原體16SrI-B亞組（Aster yellows subgroup，16SrI-B 亞組）的小茴香黃化植原體DfY-1菌株（GenBank登錄號DQ381534）的核苷酸序列相似性最高，達(dá)99.5%;與其他16Sr組的核苷酸序列相似性在88.3%～96.0% （表2）。因此，黃化慈姑植株中存在的植原體屬于翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。將此植原體暫命名為慈姑黃化植原體中國分離物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1）。

2. 4 慈姑黃化植原體16S rRNA序列系統(tǒng)進(jìn)化地位分析結(jié)果

根據(jù)AY-China和GenBank中15個(gè)植原體分組代表菌株的16S rRNA序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)16個(gè)分離物形成兩大分支，其中16SrV、16SrVI、16SrVII、16SrVIII、16SrIV、16SrIX、16SrXI、16SrXIV、16SrIII、16SrII和16SrXV組的分離物聚到一起，而16SrX、16SrXIII、16SrXII、16SrI和Arrowhead yellows形成另一分支。再選取16SrI中各亞組的代表菌株與AY-China構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AY-China與小茴香黃化植原體（Dogfennel yellows，DfY-1菌株）的關(guān)系最近，且二者的16S rRNA序列相似性達(dá)99.5%，說明AY-China屬于16SrI-B亞組。

3 討論

3. 1 應(yīng)用高通量測序鑒定未知病原物的優(yōu)勢

傳統(tǒng)的病原鑒定主要通過病害典型癥狀對其可能的病原物種類進(jìn)行初步鑒定，再結(jié)合生物學(xué)接種、血清學(xué)、電鏡或PCR等技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)為病原物檢測提供了新途徑，將高通量測序結(jié)果與微生物基因信息數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，不僅可迅速鑒定出各類病原微生物，還能通過未知序列鑒定新的物種（潘嵩等，2014）。利用該技術(shù)可一次性檢測獲得樣品中可能感染的多種病原物信息，特別適合于鑒定多種不同病原物混合侵染的樣品。目前，該技術(shù)在動植物病原微生物鑒定中已得到廣泛應(yīng)用（李洋和蘇曉紅，2016;馬宇欣和李世訪，2016;曹毅等，2017）。此外，高通量測序技術(shù)相對于第一代Sanger測序技術(shù)具有通量高、單堿基測序成本低和靈敏度高等優(yōu)勢。同時(shí)，深度測序可檢測復(fù)雜樣品中非常低豐度的成員，極大提高復(fù)合樣品中檢疫性病原物的檢出率（潘嵩等，2014）。

3. 2 慈姑黃化植原體的防治建議

目前植原體分類體系主要分為15個(gè)組和若干個(gè)亞組，并且已公布23種植原體的基因組全序列，包括玉米叢矮植原體（Maize bushy stunt phytoplasma）（Bedendo et al.，1997）、翠菊黃化植原體（Aster yellows phytoplasma）（Bai et al.，2006）、蘋果叢生植原體（Candidatus Phytoplasma mali）（Kube et al.，2008）、洋蔥黃化植原體（Onion yellows phytoplasma）（Ishii et al.，2009）、蕓香植原體（‘Brassica napus’ Phytoplasma）（Petrzik et al.，2011）、澳大利亞植原體候選種（Candidatus Phytoplasma australiense）（Andersen et al.，2013）、花生叢枝病植原體（Peanut witches’-broom phytoplasma）（Chung et al.，2013）和小麥藍(lán)矮植原體（Wheat blue dwarf phytoplasma）（Chen et al.，2014）等。由于國際間的種苗調(diào)運(yùn)和農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易等增加了植原體傳播的風(fēng)險(xiǎn)，該病害對農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成的損失日益加重，在我國已有14種植原體被列為入境檢疫性有害生物（牟海青等，2011）。植原體主要定殖于植物韌皮部篩管細(xì)胞中，可通過葉蟬、飛虱、木虱、蝽和蚜蟲等刺吸式口器昆蟲傳播，引起多種重要作物病害（牟海青等，2011;王真輝等，2013;楊毅等，2014;魏振等，2018）。因此，根據(jù)植原體病害主要依靠昆蟲介體等途徑傳播這一特性，可通過阻斷傳播途徑進(jìn)行防治。此外，植原體是柔膜菌綱病原體，無細(xì)胞壁，只有3層膜包被，對青霉素等一般殺細(xì)菌抗生素不敏感，目前主要使用四環(huán)素類抗生素（金霉素、土霉素和脫甲基氯四環(huán)素）及IBA等生長素類物質(zhì)進(jìn)行防治，效果較明顯（劉仲健和羅煥亮，1999）。再者，慈姑主要采用球莖或頂芽進(jìn)行無性繁殖，一旦感染植原體就會代代相傳。因此，預(yù)防慈姑黃化病應(yīng)采用種植健康種苗和防蟲治蟲的大田綜合防治方案。

3. 3 慈姑黃化植原體的傳播介體

篩選確定傳播植原體的介體昆蟲有利于其病害的綜合防控和治理。本研究在進(jìn)行田間病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)有黃化癥狀的慈姑假莖上出現(xiàn)大量蚜蟲，推測蚜蟲是傳播該病害的介體昆蟲。目前對于蚜蟲是否能傳播植原體仍存在很大爭議（王真輝等，2013），因?yàn)橥ㄟ^檢測昆蟲體內(nèi)是否含有植原體DNA不能作為判斷昆蟲為植原體傳播介體的依據(jù)，必須確定植原體能克服昆蟲腸道和唾液腺的障礙，定殖并隨昆蟲的取食而將植原體傳播到寄主植物上，才能確認(rèn)該昆蟲為介體（盧恒宇，2016）。此外，侵染慈姑導(dǎo)致黃化病的植原體是否具有遺傳多樣性以及是否存在其他傳播介體，均需要進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究在利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)獲取病原物序列信息的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，通過PCR和克隆測序快速鑒定引起慈姑黃化病的病原為慈姑黃化植原體中國分離物（Strain：AY-China;GenBank Accession No. MH428835.1），經(jīng)與GenBank收錄的15個(gè)分組植原體代表種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，明確慈姑植原體AY-China的分類地位為翠菊黃化植原體16SrI-B亞組。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）