鮰愛(ài)德華氏菌的紅色熒光蛋白標(biāo)記及其應(yīng)用

劉春 陳曉虹 姜蘭 曹際振 李凱彬 王英英 常藕琴 王芳石存斌 林明輝 王慶

摘要：為研究鲴愛(ài)德華氏菌與宿主的相互作用關(guān)系，本研究構(gòu)建帶有紅色熒光蛋白基因的pMDmCherry表達(dá)載體，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將載體成功導(dǎo)人鮰愛(ài)德華氏菌zb1141菌株中，獲得了紅色熒光蛋白標(biāo)記的鲴愛(ài)德華氏菌菌株。在倒置熒光顯微鏡下觀察，重組鲴愛(ài)德華氏菌顯示特異性紅色熒光。穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明，標(biāo)記菌株傳至28代，重組質(zhì)粒穩(wěn)定率仍為100%。用標(biāo)記菌株感染斑馬魚仔魚后，能在激光共聚焦顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察到細(xì)菌在魚體內(nèi)的分布情況;標(biāo)記菌株體外感染小鼠巨噬細(xì)胞后，也能觀察到病原菌與巨噬細(xì)胞的相互作用情況。說(shuō)明標(biāo)記菌株具有良好的特異性和可視性，為鮰愛(ài)德華氏菌對(duì)宿主的致病性研究提供了一種良好的生物材料。

關(guān)鍵詞：鮰愛(ài)德華氏菌;紅色熒光蛋白;斑馬魚;巨噬細(xì)胞

中圖分類號(hào)： S917.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（ 2019） 03-0661-06

鮰愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）隸屬腸桿菌科、愛(ài)德華氏菌屬，是一種兼性的胞內(nèi)寄生菌，可感染斑點(diǎn)叉尾鲴等多種名特魚類[1]。魚體感染后表現(xiàn)為內(nèi)臟器官的充血、出血、炎癥、變性和壞死，嚴(yán)重的在頭部形成開放性的潰瘍?cè)頪2]。自1979年，Hawke首次報(bào)道鮰愛(ài)德華氏菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰以來(lái)，該細(xì)菌在世界各地迅速蔓延，目前已在澳大利亞、泰國(guó)、越南、日本、中國(guó)等相繼發(fā)現(xiàn)鮰愛(ài)德華氏菌感染魚類發(fā)病，感染對(duì)象包括南方大口鲇、斑點(diǎn)叉尾鲴、黃顙魚、長(zhǎng)吻鮠、鰻鯰和虹鱒等，發(fā)病率和死亡率均較高，嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3-6]。為了有效地預(yù)防和控制鮰愛(ài)德華氏菌病的發(fā)生與傳播，研究鮰愛(ài)德華氏菌對(duì)宿主的致病性及感染途徑，深刻認(rèn)識(shí)其致病機(jī)理顯得尤為重要。

熒光蛋白是部分生物體產(chǎn)生的在特定波長(zhǎng)光照射下可激發(fā)對(duì)應(yīng)顏色熒光的蛋白質(zhì)。熒光蛋白激發(fā)的熒光具有檢測(cè)靈敏性高、特異性強(qiáng)和細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)[7]，大量研究結(jié)果顯示，熒光蛋白是理想的熒光標(biāo)記物，利用熒光蛋白標(biāo)記病原菌，對(duì)其進(jìn)行定位和示蹤，可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌在體內(nèi)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，研究病原菌入侵的動(dòng)態(tài)過(guò)程[8]。目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，已有相關(guān)用熒光蛋白標(biāo)記遲緩愛(ài)德華氏菌（Edwardsiellatarda）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）等致病菌及其對(duì)宿主的侵染途徑的研究報(bào)道[9-11]。

本研究從患病斑馬魚體內(nèi)分離出l株高致病性的鮰愛(ài)德華氏菌，構(gòu)建帶有mCherry基因的pMDmCherry載體，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化到鲴愛(ài)德華氏菌中。進(jìn)一步將mCherry基因標(biāo)記的鲴愛(ài)德華氏菌感染斑馬魚仔魚和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，利用激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)菌在魚體內(nèi)的擴(kuò)散分布情況及標(biāo)記細(xì)菌與體外巨噬細(xì)胞的相互作用關(guān)系。本研究為mCherry標(biāo)簽進(jìn)行細(xì)菌標(biāo)記使菌落觀察更具可視性和特異性提供數(shù)據(jù)支持，也為鮰愛(ài)德華氏菌對(duì)宿主的致病性及感染途徑研究提供更加便捷、可行的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鮰愛(ài)德華氏菌菌株zbl141由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，含啟動(dòng)子的質(zhì)粒PRUAL和含紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pLVX-PAnzCherry-C1由本實(shí)驗(yàn)室保存。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自廣州市哈藍(lán)生物科技有限公司，胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽（MS-222）、1-苯基-2-硫脲為Sigma公司產(chǎn)品，大腸桿菌DH5a由本實(shí)驗(yàn)室保存。膠回收試劑盒Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Taq酶、dNTP、DNA分子Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品，Plasmid Mini Kit I為Omega公司產(chǎn)品，基因組提取試劑盒（細(xì)菌）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pMDmCherry的構(gòu)建

1.2.1 啟動(dòng)子和mCherry連接片段的擴(kuò)增根據(jù)啟動(dòng)子和mCherry基因序列，利用Primer5.O軟件設(shè)計(jì)2對(duì)擴(kuò)增引物，由上海生工生物工程有限公司合成。用于擴(kuò)增啟動(dòng)子基因的上游引物為PPS：5’-CGC-CTAGGATACGCACACCGTGGAAAC-3'，下游引物為PPA：5’_CCrITGCTCACCArITITITCrITCCTCCA_3’;擴(kuò)增mCherry基因的上游引物為MCS：5’-AG-GAAGAAAAAATGGTGAGCAAGGGTGA-3’，下游弓l物為MCA：5’-GCGTTCGAATTACTACTTGTACAGC-T-3’。

以質(zhì)粒PRUAL為模板，PPS/PPA為引物，按照常規(guī)PCR方法擴(kuò)增啟動(dòng)子基因序列，反應(yīng)條件為95 cC 2 min;94℃30 s，56℃40 s和72℃90 s，35個(gè)循環(huán)，72 cc延伸10 min。以質(zhì)粒pLVX-PAmCher-ry-CI為模板，MCS/MCA為引物，PCR擴(kuò)增mCherry基因序列。瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物。

采用融合PCR方法，由于設(shè)計(jì)時(shí)PPA和MCS引物有一段重復(fù)序列，因而PCR擴(kuò)增的啟動(dòng)子和mCherry基因就含有互補(bǔ)片段。以純化的的啟動(dòng)子和mCherry產(chǎn)物1：1混合作為模板，常規(guī)PCR方法不加引物擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，結(jié)束后直接添加PPS、MCA作為上下游引物，PCR方法擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2 重組質(zhì)粒連接、轉(zhuǎn)化與鑒定 將方法1.2.1純化回收的啟動(dòng)子和mCherry連接片段與pMD18-TVector克隆載體（TaKaRa） 16℃連接2h后，轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性單菌落，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序確認(rèn)，構(gòu)建好的pMDmCherry質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 重組鮰愛(ài)德華氏菌的構(gòu)建

參照杜以帥等[91的方法制備鮰愛(ài)德華氏菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞。分別取100 ng構(gòu)建的pMDmCherry質(zhì)粒和70μl鮰愛(ài)德華氏菌感受態(tài)細(xì)胞于預(yù)冷的1mm電轉(zhuǎn)杯中混勻，在2.1 kV、25 μF、400 Q條件下，快速電脈沖，脈沖時(shí)間為5 ms。電擊結(jié)束后加入l ml BHI培養(yǎng)液，在28℃100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3h。4℃.5 000 r/min離心10 min，棄掉800μl上清液，重懸細(xì)菌沉淀，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含羧芐青霉素（ Amp）抗性的BHI瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)48 h。

1.4 mCherry標(biāo)記的鮰愛(ài)德華氏菌的篩選與鑒定

1.4.1 熒光檢測(cè)取20μl的陽(yáng)性克隆菌菌液均勻涂布在載玻片上，用TI-S熒光顯微鏡（Nikon，日本）下觀察，同時(shí)以野生菌株作為陰性對(duì)照，挑選能發(fā)出強(qiáng)烈紅色熒光信號(hào)的菌株。

1.4.2 PCR鑒定挑取發(fā)紅色熒光的菌株，用引物MCS/MCA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同方法1.2.1，PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后測(cè)序確認(rèn)。

1.4.3 質(zhì)粒穩(wěn)定性試驗(yàn)參照李靜等[1O]的方法并改進(jìn)，將標(biāo)記好的細(xì)菌在含有Amp的BHI中28℃培養(yǎng)過(guò)夜，接種量為111 000（體積比），每24 h轉(zhuǎn)接1次。同時(shí)取200μl涂布于含Amp抗性的BHI瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)24 h后，分別挑取單菌落在熒光顯微鏡下檢測(cè)，記錄熒光數(shù)。質(zhì)粒穩(wěn)定率=發(fā)紅色熒光菌落數(shù)/總菌落數(shù)×100%。

1.5 標(biāo)記的鮰愛(ài)德華氏菌在感染斑馬魚仔魚體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布檢測(cè)

健康的雌性斑馬魚與雄性斑馬魚進(jìn)行交配，收集所產(chǎn)的受精卵。受精后12 h的受精卵用0.20mmol/L的1一苯基-2-硫脲浸泡，抑制黑色素生成。取剛孵化出膜的仔魚，經(jīng)0. 020-/0 MS-222麻醉后，顯微注射標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌菌液（lx10CFU/ml），控制顯微注射液滴大小使注射體積為1 nl（即每尾仔魚100 CFU），分別在感染后Oh、12 h、24 h用激光共聚焦顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)菌在魚體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況，另外設(shè)一個(gè)未感染組作為陰性對(duì)照。

1.6標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌與小鼠巨噬細(xì)胞體外的相互作用

RAW264.7傳代至8孔腔室載玻片中，每孔加入300μl新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清），在5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)20 h。為了便于觀察，細(xì)胞貼壁50%左右時(shí)，加入30μl經(jīng)麥?zhǔn)媳葷岱ㄏ♂尩臉?biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌，終濃度為1×10CFU/ml，侵染時(shí)間分別為Oh、4h、24 h、48 h、72 h。侵染完成后用FluoView FV1200激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus Japan）進(jìn)行觀察，另外設(shè)一個(gè)未感染組作為陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pMDmCherry的構(gòu)建

以質(zhì)粒PRUAL為模板，用特異性引物擴(kuò)增啟動(dòng)子基因，長(zhǎng)度約300 bp（圖1）。以質(zhì)粒pLVX-PAmCherry-C1為模板，用特異性引物擴(kuò)增mCherry基因，長(zhǎng)度約700 bp;2個(gè)片段連接擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 000bp左右（圖1）。連接片段克隆至質(zhì)粒pMD18-T，重組質(zhì)粒雙酶切后，切出大小約為1000 bp和2 700bp 2條DNA片段，分別與pMD18-T和連接片段基因大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果也顯示連接片段堿基沒(méi)有發(fā)生任何突變，即成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDmCherry，構(gòu)建圖譜見(jiàn)圖2。

2.2 mCherry標(biāo)記的鮰愛(ài)德華氏菌的篩選與鑒定

陽(yáng)性克隆菌用熒光顯微鏡觀察，篩選出了穩(wěn)定高效表達(dá)紅色熒光蛋白的菌株（圖3）。以篩選出的重組菌株為模板，用引物MCS/MCA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得700 bp左右的片段，經(jīng)過(guò)測(cè)序確認(rèn)為mCherry基因片段;目前標(biāo)記菌株已傳至28代，所有菌落均發(fā)紅色熒光，質(zhì)粒穩(wěn)定率可達(dá)100%。這些結(jié)果表明，重組質(zhì)粒能夠在鲴愛(ài)德華氏菌中穩(wěn)定表達(dá)，紅色熒光標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌構(gòu)建成功。

2.3 標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌在感染斑馬魚仔魚體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布

標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌顯微注射感染斑馬魚仔魚后，在感染部位及附近血管中呈現(xiàn)紅色熒光（圖4B）;感染12 h，紅色熒光增多，出現(xiàn)在仔魚內(nèi)臟部位（圖4C）;感染24 h，在內(nèi)臟、肌肉及血液中都有大量紅色熒光出現(xiàn)（圖4D）。陰性對(duì)照組無(wú)熒光（圖4A）。

2.4 標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌與小鼠巨噬細(xì)胞在體外的相互作用

激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組巨噬細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)呈較規(guī)則的圓形或橢圓形（圖SA）;感染Oh觀察到紅色標(biāo)記細(xì)菌游離在培養(yǎng)基中，少量貼壁細(xì)胞開始變形，出現(xiàn)梭形細(xì)胞和多角形（圖SB）;感染4h，游離紅色標(biāo)記細(xì)菌聚集增多，少量巨噬細(xì)胞開始吞噬標(biāo)記細(xì)菌（圖5C）;感染24 h游離標(biāo)記細(xì)菌大量增加，部分巨噬細(xì)胞吞噬病原菌（圖SD）;感染48 h，游離標(biāo)記細(xì)菌減少，巨噬細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記細(xì)菌大量增殖，有少量細(xì)胞破裂死亡（圖SE）;感染72 h，標(biāo)記細(xì)菌明顯減少，巨噬細(xì)胞大量脫落死亡（圖SF）。

3 討論

應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行標(biāo)記，觀察病原侵染軌跡，是研究病原致病過(guò)程，了解病原宿主相互作用機(jī)理的有效手段[12]。本研究目的是探討鮰愛(ài)德華氏菌在宿主體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化，研究病原菌與宿主的相互作用關(guān)系。為了跟蹤病原菌活體狀態(tài)下的致病過(guò)程，就需要選擇一種既穩(wěn)定又可靠的標(biāo)記物。mCherry是一種來(lái)自于蘑菇珊瑚的紅色熒光蛋白，相對(duì)于其他熒光蛋白，mCherry具有對(duì)光致漂白作用耐受、熒光亮度高、光穩(wěn)定性卓越、可與綠色熒光蛋白共同標(biāo)記研究對(duì)象等諸多優(yōu)點(diǎn)，因而得到廣泛的應(yīng)用[13-15]。本研究利用電轉(zhuǎn)化法將紅色熒光蛋白基因mCherry導(dǎo)入zbl141菌株，得到的轉(zhuǎn)化菌株保持了和野生型相似的菌落形態(tài)，插入基因能穩(wěn)定遺傳，能使mCherry蛋白在入侵巨噬細(xì)胞及宿主的菌株中表現(xiàn)出高強(qiáng)度表達(dá)，使鮰愛(ài)德華氏菌致病機(jī)理的相關(guān)研究變得更加便捷。

合適的質(zhì)粒載體和啟動(dòng)子是決定mCherry重組質(zhì)粒能否在鲴愛(ài)德華氏菌中高效穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵因素。pMD18-T是一種廣泛應(yīng)用于高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體，這種載體拷貝數(shù)高，分子量較小，易于轉(zhuǎn)化，但其自身不帶啟動(dòng)子。啟動(dòng)子活性高低在很大程度上影響外源蛋白質(zhì)的表達(dá)，研究結(jié)果表明慶大霉素抗性啟動(dòng)子（ Gentamycin-resistancepromoter）能高效啟動(dòng)GFP在諾卡氏菌（ⅣocardLabrasiliensis）中的表達(dá)[16-17]。本試驗(yàn)中使用pMD18-T作為載體，利用慶大霉素抗性啟動(dòng)子融合mCherry基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至鮰愛(ài)德華氏菌中。熒光檢測(cè)結(jié)果表明，構(gòu)建的質(zhì)粒能在鮰愛(ài)德華氏菌中高效表達(dá)，且多次傳代后，標(biāo)記細(xì)菌依然能夠發(fā)出較強(qiáng)的紅色熒光。

傳統(tǒng)的研究病原菌在動(dòng)物體內(nèi)侵染的動(dòng)力學(xué)方法，主要是通過(guò)病原菌感染動(dòng)物后，用平板培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)測(cè)定不同器官中病原菌含量，這是一種間接的方法，不能直觀反映病原菌的入侵情況，試驗(yàn)動(dòng)物間個(gè)體差異也會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[9];放射性標(biāo)記的方法可以定量檢測(cè)細(xì)菌，但是放射性物質(zhì)對(duì)生物體有毒性，且這種方法也不能區(qū)分死亡的和活的細(xì)菌[18]。本研究中利用構(gòu)建的紅色熒光標(biāo)記鮰愛(ài)德華氏菌后，通過(guò)顯微注射感染斑馬魚仔魚，由于斑馬魚仔魚身體是透明的，在激光共聚焦顯微鏡下借助綠色激光，可清晰觀察到斑馬魚體內(nèi)的紅色標(biāo)記細(xì)菌，在不處死動(dòng)物的情況下可對(duì)魚體內(nèi)病原菌的變化進(jìn)行連續(xù)觀察，在同一動(dòng)物身上能獲得一系列的動(dòng)態(tài)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，更為直觀、綜合地了解整個(gè)感染過(guò)程，提高研究的效率。

巨噬細(xì)胞是天然免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞，可以有效吞噬和消化外來(lái)物質(zhì)，它是機(jī)體抵御外來(lái)微生物侵襲的第一道防線[19-20]。有研究報(bào)道鮰愛(ài)德華氏菌是一種兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，它可以在斑點(diǎn)叉尾鲴和南方鲇等魚類宿主巨噬細(xì)胞中生存、繁殖[6，12]，因而了解鮰愛(ài)德華氏菌與巨噬細(xì)胞的相互作用關(guān)系，特別是研究鮰愛(ài)德華氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)入侵、存活及繁殖機(jī)制是研究鮰愛(ài)德華氏菌致病性的關(guān)鍵。馬慧等[22]將布魯氏菌（Brucella melitensis）體外感染小鼠巨噬細(xì)胞后，利用綠色熒光標(biāo)記的菌株結(jié)合紅色熒光探針標(biāo)記的溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細(xì)胞器，研究測(cè)定了侵染細(xì)菌與胞內(nèi)各細(xì)胞器結(jié)合的時(shí)間，為布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制提供了理論參考。目前有學(xué)者建立了與鮰愛(ài)德華氏菌同屬的遲緩愛(ài)德華氏菌小鼠巨噬細(xì)胞感染模型，并用小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行了病原與宿主互作關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)了遲緩愛(ài)德華氏菌與宿主互作的新機(jī)制[ 23-24]。

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