九香蟲(chóng)溶菌酶基因CcLys的克隆與特征分析

張振娟 齊小浪 李尚偉 喻廷君 杜娟

摘 要：九香蟲(chóng)Coridius chinensis是我國(guó)一種重要的藥食兩用昆蟲(chóng)，溶菌酶是一種具有抗菌作用的糖苷水解酶。該研究從九香蟲(chóng)中克隆了一種溶菌酶基因CcLys，其cDNA長(zhǎng)883 bp，包含一個(gè)669 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼222個(gè)氨基酸。九香蟲(chóng)溶菌酶CcLys的N-端包含一段由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，成熟CcLys形成7個(gè)α-螺旋，8個(gè)β-折疊片的三維結(jié)構(gòu)。同源性和聚類分析顯示CcLys與茶翅蝽Halyomorpha halys溶菌酶的親緣關(guān)系最近?；虮磉_(dá)譜分析表明，CcLys在九香蟲(chóng)的整個(gè)發(fā)育階段都有表達(dá)，在3齡若蟲(chóng)中表達(dá)水平最高;該基因在所檢測(cè)的成蟲(chóng)組織中都有表達(dá)，在脂肪體中表達(dá)水平最高。成蟲(chóng)被細(xì)菌誘導(dǎo)后，CcLys的表達(dá)水平在12 h達(dá)到峰值。該研究為進(jìn)一步明確CcLys基因的功能及開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：九香蟲(chóng);溶菌酶;糖苷水解酶;基因表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）03-00-0 國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.001

Abstract：Coridius chinensis is an important insect used for both medicine and food source in China，and lysozyme is a glycoside hydrolase with antimicrobial activity. In this study，alysozyme gene，designated CcLys，was cloned from C. chinensis. The CcLys cDNA was 883 bp in length which contained a 669 bp open reading frame （ORF） that encoded 222 amino acids. CcLys contained a signal peptide composed of 18 amino acids at N-terminus，and the mature CcLys formed a three-demensional structure consisted of 7 α-helix and 8 β-pleated sheets. Homology and cluster analyses showed that CcLys possesses the closest relationship with that of Halyomorpha haly. Gene expression analyses indicated that CcLys was expressed throughout the developmental stages of C. chinensis with the highest expression level in the 3rd instar nymph，and this gene was expressed in the adult tissues tested with the highest expression level in the fat body. The mRNA expression level of this gene peaked at 12 h post induction by bacteria. This study will provide a foundation for further understanding the function of CcLys gene and developing new antimicrobial drugs.

Key words：Coridius chinensis; lysozyme; glycoside hydrolase; gene expression pattern

昆蟲(chóng)在外界因素（細(xì)菌、真菌等病原體）刺激下激活體內(nèi)的先天性免疫途徑，產(chǎn)生抗菌肽等體液免疫因子，有效地抵御病原體的侵染[]。溶菌酶是參與這種保護(hù)機(jī)制的重要分子之一。溶菌酶（lysozyme）是一個(gè)龐大而多樣的肽聚糖水解酶家族，又稱胞壁質(zhì)酶（muramidase），廣泛存在于自然界，具有抗菌、消炎、抗病毒和消化等多種作用[]，具有生物相容性好、對(duì)組織無(wú)刺激無(wú)毒性的特點(diǎn)，已被作為一種殺傷病原微生物而不破壞機(jī)體的優(yōu)質(zhì)酶制劑。溶菌酶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，商品化產(chǎn)品主要來(lái)自于蛋清溶菌酶，僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有抑制作用，為此國(guó)內(nèi)外科研人員一直致力于開(kāi)發(fā)新型溶菌酶;更多溶菌酶的不斷發(fā)現(xiàn)和對(duì)該酶的深入研究，使其在商業(yè)和醫(yī)療應(yīng)用顯現(xiàn)出巨大的潛力和價(jià)值[]。

根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和來(lái)源的不同，溶菌酶分為6類：C型（雞型溶菌酶）、G型（鵝型溶菌酶）、I型（無(wú)脊椎動(dòng)物型溶菌酶）、噬菌體型、細(xì)菌型和植物型[]。從后生動(dòng)物中已經(jīng)鑒定出C、G和I型三種溶菌酶，它們都能水解細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid，NAM）和N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetylglucosamine，NAG）之間的β-1，4-糖苷鍵[]。動(dòng)物性溶菌酶分布廣泛，主要存在于動(dòng)物的免疫器官、免疫細(xì)胞、消化系統(tǒng)以及高等動(dòng)物的分泌物中。C型溶菌酶是截止目前被眾多學(xué)者研究得最多和最深入的類型，該類溶菌酶大多都來(lái)自于昆蟲(chóng)以及脊椎動(dòng)物[]。不同種類的溶菌酶蛋白的氨基酸排列不同，但是都具有保守的酶活性位點(diǎn)，發(fā)揮水解功能;C型溶菌酶的活性中心含有必需基因Asp和Glu[]。

九香蟲(chóng)Coridius chinensis是我國(guó)重要的藥用昆蟲(chóng)，隸屬于昆蟲(chóng)綱半翅目蝽科瓜蝽屬，具有理氣止痛、溫中助陽(yáng)之功能[]。九香蟲(chóng)是一種藥食兩用昆蟲(chóng)，在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布，具有極大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[]。該蟲(chóng)在自然界中很少發(fā)生被病原微生物感染而導(dǎo)致死亡的情況，這要?dú)w功于它的先天免疫系統(tǒng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，九香蟲(chóng)對(duì)金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、甲型副傷寒桿菌和福氏痢疾桿菌具有很強(qiáng)的抗菌作用[]。吳瑪莉等[]用凝膠過(guò)濾法從九香蟲(chóng)血淋巴的上清液中分離提純獲得一種1-14.4 kDa的抑菌小分子肽，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有抑制作用。李尚偉等[]對(duì)九香蟲(chóng)血淋巴進(jìn)行質(zhì)譜分析得到了10條短肽，并對(duì)其中一條短肽進(jìn)行了抗菌活性研究，結(jié)果表明該肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌均具有明顯的抑菌作用。本研究用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse-transcription PCR，RT-PCR）從九香蟲(chóng)中克隆了溶菌酶基因，命名為CcLys，并對(duì)其進(jìn)行特征分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能、開(kāi)發(fā)新型的抗菌藥物及九香蟲(chóng)資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)昆蟲(chóng)和樣品收集

對(duì)采自野外的九香蟲(chóng)成蟲(chóng)在貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)，溫度為（25±1）℃，相對(duì)溫度70%左右，光周期14L∶10D。收集卵、1～5齡若蟲(chóng)、成蟲(chóng)以及成蟲(chóng)的不同組織（頭部、肌肉、體壁、脂肪體、睪丸和卵巢）樣本，置于RNAlater（Qiagen，Duesseldorf，Germany）中在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

HP TotalRNA Kit 購(gòu)于美國(guó) Omega Bio-Tek 公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit和2× SYBR Select Master Mix購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher科技有限公司;大腸桿菌 Escherichia coli TOP10 感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA marker和PrimeScript RT-PCR Kit均購(gòu)于大連TaKaRa公司;T100 Thermal Cycler 和C1000 Thermal Cycler購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司;其他常規(guī)試劑與耗材均購(gòu)自于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

使用HP Total RNA Kit（Omega Bio-Tek，GA，USA）提取4齡若蟲(chóng)總RNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。RNA的純度和質(zhì)量分別用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher，MA，USA）和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。以提取的九香蟲(chóng)總RNA為模板，用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher，MA，USA）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 九香蟲(chóng)溶菌酶基因克隆

根據(jù)九香蟲(chóng)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋的溶菌酶基因序列，用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)PCR引物，由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。在T100 Thermal Cycler（Bio-Rad，CA，USA）上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）。PCR反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2× TsingKe Master Mix（北京擎科生物公司），2 μL cDNA模板，上、下游引物（10 μM）各1 μL，補(bǔ)加21 μL滅菌超純水。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列用BLAST在NCBI的Nr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。

1.5 生物信息學(xué)分析

CcLys基因的編碼區(qū)用NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行預(yù)測(cè)，用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分子量和等電點(diǎn)預(yù)測(cè)。采用SignalP 4.1 Server（http：www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析預(yù)測(cè)信號(hào)肽，用NetOGlyc 4.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGlyc 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預(yù)測(cè)糖基化位，用KinasePhos（http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/）預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)。用MEGA-X和GeneDoc 2.7將CcLys氨基酸序列與其他11種來(lái)自昆蟲(chóng)和細(xì)菌的溶菌酶氨基酸序列進(jìn)行對(duì)齊分析;使用MEGA-X進(jìn)行聚類分析。用于多序列對(duì)齊和聚類分析的溶菌酶來(lái)源物種及GenBank登錄號(hào)列于表2中。使用 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）的同源建模方法預(yù)測(cè)成熟CcLys酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)，用PyMOL 1.4繪制其分子結(jié)構(gòu)圖。

1.6 基因表達(dá)譜分析

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析在九香蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期、成蟲(chóng)的不同組織及成蟲(chóng)免疫后不同時(shí)間溶菌酶CcLys基因的表達(dá)模式。用金黃色葡萄球菌（Staphylocous aureus）和大腸桿菌（E. coli）的等量混合物分別對(duì)20只健康的成蟲(chóng)進(jìn)行腹部注射，分別在3、6、12、24、36和48 h收集存活的成蟲(chóng)樣品。提取這些樣品的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后在C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad，CA，USA）上進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系為20 μL：1 μL cDNA模板，上、下游引物（20 mM）各1 μL，10 μL 2× SYBR Select Master Mix（Thermo Fisher，MA，USA），補(bǔ)加7 μL 無(wú)RNA酶的滅菌超純水。反應(yīng)條件：50℃，2 min;95℃，2 min;95℃變性15，58℃退火15，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。用九香蟲(chóng)β-actin基因（GenBank登錄號(hào)：MK370101）作內(nèi)參對(duì)照，相關(guān)的引物列于表1。用2 -ΔΔCt方法分析CcLys的mRNA表達(dá)水平，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件方差分析（ANOVA）的鄧肯氏新復(fù)極差法（Duncan’s test）進(jìn)行多重檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平為P< 0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 CcLys的cDNA克隆

以4齡若蟲(chóng)總RNA為模板經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到九香蟲(chóng)溶菌酶基因CcLys的cDNA（GenBank登錄號(hào)：MK526903）。該cDNA長(zhǎng)883 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)669 核苷酸（nt）的開(kāi)放閱讀框，編碼222個(gè)氨基酸;5端有66 nt的非編碼區(qū)（UTR），3端有148 nt的UTR。該溶菌酶CcLys的N端具有一段由18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽（圖1）。

2.2 CcLys特征分析

CcLys酶蛋白的分子式為C1121H1718N310O331S7，分子量為25.06 kDa，理論等電點(diǎn)為7.7。該酶蛋白在N209具有N-糖基化位點(diǎn)，無(wú)O-糖基化位點(diǎn)，有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)（S16、T52、Y57、T67、S167、S168和S211）。BLAST分析表明，CcLys含有糖基水解酶25家族（GH25）催化結(jié)構(gòu)域。同源建模分析顯示，成熟CcLys的三維分子結(jié)構(gòu)包括7個(gè)α-螺旋，8個(gè)β-折疊片，15個(gè)無(wú)規(guī)卷曲（圖2）。

2.3 同源性比較與聚類樹(shù)

將CcLys氨基酸序列在NCBI的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示該溶菌酶與茶翅蝽、點(diǎn)蜂緣蝽和擬果蠅沃爾巴克氏內(nèi)共生菌的溶菌酶氨基酸序列分別具有61%、52%和52%的相似性。CcLys氨基酸序列與來(lái)自于7種昆蟲(chóng)和4種細(xì)菌的溶菌酶氨基酸進(jìn)行對(duì)齊，結(jié)果顯示他們都具有保守的谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）和色氨酸（W），這3種氨基酸是溶菌酶活性中心的必需基團(tuán);具有DXE保守序列（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，CcLys與茶翅蝽溶菌酶首先聚為一支，再與點(diǎn)蜂緣蝽溶菌酶聚為一支;棉蚜與豌豆蚜的溶菌酶聚為一支;3種螞蟻溶菌酶聚為一支，再與擬果蠅沃爾巴克氏內(nèi)共生菌的溶菌酶聚為一支;來(lái)自煙粉虱和潮蟲(chóng)的沃爾巴克氏內(nèi)共生菌溶菌酶聚為一支（圖4）。同源性比較和聚類分析表明，九香蟲(chóng)溶菌酶與茶翅蝽溶菌酶的親緣關(guān)系最近。

2.4 CcLys基因表達(dá)模式

RT-qPCR分析顯示，CcLys在九香蟲(chóng)的所有發(fā)育階段都有表達(dá)，在若蟲(chóng)期的表達(dá)水平較高，在成蟲(chóng)的表達(dá)水平次之，在卵中的表達(dá)水平最低;在3齡若蟲(chóng)中的表達(dá)水平最高，是成蟲(chóng)的33倍、卵的395倍（圖5）。該基因在所檢測(cè)的成蟲(chóng)組織中都有表達(dá)，在脂肪體中的表達(dá)水平最高，在肌肉中的表達(dá)最低;表達(dá)水平從高到低的組織依次是：脂肪體>卵巢>精巢>頭部>體壁>肌肉，在脂肪體中的表達(dá)水平是在肌肉中的39304倍（圖6）。九香蟲(chóng)成蟲(chóng)在被大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合菌液刺激后，CcLys表達(dá)先下調(diào)然后上調(diào)，在12 h達(dá)到峰值，之后又下降;在36 h和48 h表達(dá)水平?jīng)]有變化。CcLys基因在誘導(dǎo)后12 h的表達(dá)水平是誘導(dǎo)前的2455倍，是誘導(dǎo)后3 h的9676倍（圖7）。

3 結(jié)論與討論

溶菌酶是一種抗菌酶，是昆蟲(chóng)先天免疫系統(tǒng)的一部分。它是一種糖苷水解酶，水解兩種或多種碳水化合物之間或碳水化合物和非碳水化合物之間的糖苷鍵。基于序列相似性的糖基水解酶分類系統(tǒng)已經(jīng)定義了85個(gè)不同的家族[]。糖苷水解酶第25 家族（GH25）僅包含一種具有已知活性的酶，該酶主要水解肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間及殼聚糖中N-乙酰-D-氨基葡萄糖殘基間的β-1，4-糖苷鍵。許多細(xì)胞壁裂解酶是共同進(jìn)化的，可以歸為一個(gè)家族[]。Glu和Asp兩個(gè)殘基對(duì)溶菌酶的催化活性極其重要，這些殘基以及它們附近的一些其他殘基在這個(gè)家族的所有蛋白質(zhì)成員中都是保守的[]。GH25家族溶菌酶都含有一段DXE保守序列，該功能域負(fù)責(zé)識(shí)別和切斷β-l，4-糖苷鍵。CcLys含有GH25家族溶菌酶高度保守的Glu和Asp這兩個(gè)必需基團(tuán)，且都位于DXE基序之中，這對(duì)于九香蟲(chóng)溶菌酶發(fā)揮催化功能具有重要作用。

Martinez-Fleites等[]通過(guò)研究炭疽桿菌的GH25溶菌酶的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這個(gè)家族的溶菌酶采用類似于桶狀折疊片層的（α/β）5（β）3二級(jí)結(jié)構(gòu)。GH25溶菌酶的活性中心與同屬糖苷水解酶家族的GH18、GH20、GH56、GH84和GH85的活性中心極其相似，這意味著GH25溶菌酶很可能保留這一“超級(jí)家族”常見(jiàn)的異頭物構(gòu)型，并使用相同的鄰位催化機(jī)制。Korczynska等[]測(cè)定了煙曲霉中GH25溶菌酶的X射線結(jié)構(gòu)，第一次研究真菌中GH家族溶菌酶的結(jié)構(gòu)，改進(jìn)了α/β桶狀折疊片層模型，8個(gè)β-折疊桶兩側(cè)圍繞3個(gè)α-螺旋。活性位點(diǎn)位于這個(gè)模型帶負(fù)電的口袋底部，其構(gòu)型與GH25和相關(guān)GH家族的其他成員已揭示的結(jié)構(gòu)有很多相似之處。這些研究證實(shí)了糖苷水解酶家族通過(guò)“酶催化物輔助”催化機(jī)制起作用的觀點(diǎn)[]。預(yù)測(cè)的成熟CcLys的三級(jí)結(jié)構(gòu)由8個(gè)β-折疊片層形成桶狀構(gòu)型，7個(gè)α-螺旋圍繞在桶周圍，與GH25溶菌酶具有類似的結(jié)構(gòu)。

同源性比較和聚類分析顯示，CcLys與茶翅蝽溶菌酶的親緣關(guān)系最近，然而人們對(duì)這個(gè)酶的特征了解得較少;CcLys與其他已知昆蟲(chóng)的C型和I型溶菌酶的相似性低[]，因此，我們還無(wú)法判斷CcLys屬于哪一類溶菌酶，需要進(jìn)一步研究。CcLys基因在九香蟲(chóng)的整個(gè)生活史中均有表達(dá)，表明它在九香蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用。基因表達(dá)分析顯示CcLys在九香蟲(chóng)脂肪體表達(dá)水平高，昆蟲(chóng)脂肪體是昆蟲(chóng)體內(nèi)一種非常重要的器官，類似于高等動(dòng)物的肝臟。脂肪體既是糖類、脂類和蛋白質(zhì)代謝的中心，又是昆蟲(chóng)對(duì)激素和外源化合物進(jìn)行降解和解毒代謝的重要組織。

該研究從九香蟲(chóng)中克隆了一種溶菌酶CcLys基因，并進(jìn)行了特征分析，為進(jìn)一步明確該基因的功能、開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物及深度開(kāi)發(fā)利用九香蟲(chóng)資源奠定了基礎(chǔ)。

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