五種消毒劑對舒伯特氣單胞菌殺菌效果研究

劉枝華 涂嬌 胡雄 鄧佩儀 陳江鳳 邵儉

摘 要：為篩選對舒伯特氣單胞菌（Aeromonas schubertii）具有較好殺菌效果的消毒劑及其最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC），選用五種消毒劑（聚維酮碘、雙鏈季銨鹽碘、大蒜素、二氧化氯、復(fù)合碘）進(jìn)行殺菌實(shí)驗(yàn)，設(shè)置舒伯特氣單胞菌母液濃度為（1～2）×103 cfu/mL，五種消毒劑目標(biāo)濃度均為0.3750 mg/L。研究結(jié)果表明，雙鏈季銨鹽碘對舒伯特氣單胞菌殺菌效果最好，殺菌率為63.02%;其次是復(fù)合碘，殺菌率為43.56%。當(dāng)雙鏈季銨鹽碘和復(fù)合碘兩種消毒劑濃度為目標(biāo)濃度3倍（1.1250 mg/L）時(shí)，可全部殺滅舒伯特氣單胞菌。因此，五種消毒劑對舒伯特氣單胞菌都具有一定的殺菌效果，依次為：雙鏈季銨鹽碘>復(fù)合碘>二氧化氯>大蒜素，其中雙鏈季銨鹽碘和復(fù)合碘的效果最好，其最小殺菌濃度（MBC）為1.1250 mg/L。

關(guān)鍵詞：舒伯特氣單胞菌;消毒劑;目標(biāo)濃度;最小殺菌濃度

中圖分類號(hào)：S948

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2019）03-0089-04 國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.03.017

Abstract：In order to screen the disinfectant with good bactericidal effect on Aeromonas schubertii and find out the Minimum Bactericidal Concentration （MBC） of five disinfectant （Polyvidone iodine，Double-chain quaternary ammonium iodide，Alicin，Chloride dioxide and Compound iodine） were selected. for sterilization experiments. The concentration of A. schubertii was set to （1～2）×103 cfu/mL，and the target concentration of five disinfectants was 0.3750 mg/L. The results showed that the double-stranded quaternary ammonium iodine had the best bactericidal effect on A. schubertii，and the bactericidal rate was 63.02%. The second was iodine，and the bactericidal rate was 43.56%. Meanwhile，both Double-chain quaternary ammonium iodide and the Compound iodine demonstrated 100% bactericidal rate when the concentration of the disinfectant was 3 times （1.1250 mg/L） of the target concentration. Therefore，all of the five disinfectants have certain taking effects on A. schubertii，in an order followed by：Double-chain quaternary ammonium Iodide>Compound iodide>Chloride iodide>Alicin>Polyvidone iodide，of which double-stranded quaternary ammonium salt iodine and complex Iodine has the best effect and its minimum bactericidal concentration （MBC） is 1.1250 mg/L.

Key words：Aeromonas schuberii; sterilant; target concentration; minimum bactericidal concentration

舒伯特氣單胞菌（Aeromonas schubertii）屬氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromanas），為革蘭氏陰性桿菌，單極鞭毛，運(yùn)動(dòng)極為活潑。該菌廣泛存在于淡水、海水、土壤、魚類和脊椎動(dòng)物腸道中，是水產(chǎn)動(dòng)物的常見致病菌[1]。目前，有報(bào)道對烏鱧源舒伯特氣單胞菌WL-4菌株的生理生化、生長特性、致病因子等生物學(xué)特征，藥物的敏感性及分子生物學(xué)檢測方法[2-5]。另有研究表明，舒伯特氣單胞菌對頭孢唑啉、慶大霉素等14種藥物敏感，對青霉素G、苯唑西林2種藥物耐受[6-8]。然而，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中舒伯特氣單胞菌感染魚類時(shí)有發(fā)生，往往損失慘重[9]。為了提高烏鱧養(yǎng)殖生產(chǎn)效益，開展消毒劑對舒伯特氣單胞菌的殺菌實(shí)驗(yàn)，篩選出具有較好殺菌效果的消毒劑并明確其最小殺菌濃度，旨在降低該菌引發(fā)疾病的養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 消毒劑與實(shí)驗(yàn)菌株

五種消毒劑分別為：聚維酮碘、雙鏈季銨鹽碘、大蒜素、二氧化氯、復(fù)合碘。

實(shí)驗(yàn)用舒伯特氣單胞菌菌株由佛山市順德區(qū)活寶源生物科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌母液的制備

取適量舒伯特氣單胞菌接種于營養(yǎng)肉湯中，28℃培養(yǎng)24 h，使細(xì)菌母液為1～2麥?zhǔn)蠁挝粋溆谩?/p>

1.2.2 消毒劑的制備

配制目標(biāo)濃度為0.3750 mg/L的消毒劑：分別取不同消毒劑3.75 g加蒸餾水溶解定容于100 mL的容量瓶中，搖勻取1 mL加入1 L的容量瓶，轉(zhuǎn)移到不透光樣品瓶中密封保存?zhèn)溆谩Ｅ渲葡緞┬枞瘫芄?，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.3 消毒劑對舒伯特氣單胞菌的殺菌實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)在無菌環(huán)境下進(jìn)行，每組設(shè)置2個(gè)平行處理（A組、B組），無菌試管逐次標(biāo)記編號(hào)A1～A6，B1～B6備用。將細(xì)菌母液稀釋100倍后，從中取1 mL置于已滅菌的錐形瓶（500 mL）中，瓶中裝有200 mL蒸餾水和玻璃珠，封口后放于搖床上震蕩15 min，頻率為200 r/min。取10 mL稀釋母液分別加入各無菌試管中，按1～6#再依次加入100 μL的聚維酮碘、雙鏈季銨鹽碘、大蒜素、二氧化氯、復(fù)合碘、無菌蒸餾水，混勻避光反應(yīng)45 min后，從各試管中取100 μL分別置于相應(yīng)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿（50℃），搖勻放于37℃恒溫培養(yǎng)16 h后計(jì)數(shù)。

殺菌率=（對照組活菌數(shù)-實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)）/對照組活菌數(shù)×100%

1.2.4 消毒劑對舒伯特氣單胞菌的濃度梯度實(shí)驗(yàn)

菌液的配置、操作和殺菌率計(jì)算與1.2.4同。選用殺菌效果好的消毒劑進(jìn)行濃度梯度實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中消毒劑濃度分別設(shè)置為目標(biāo)濃度的1.5倍（0.5625 mg/L）、2倍（0.7500 mg/L）、2.5倍（0.9375 mg/L）、3倍（1.1250 mg/L）、3.5倍（1.3125 mg/L）、4倍（1.5000 mg/L），每組設(shè)置2個(gè)處理，對照組加250 μL的無菌蒸餾水。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Office 2007辦公軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對舒伯特氣單胞菌的殺菌效果

與對照組相比，各消毒劑對該細(xì)菌均有一定的抑制殺滅作用（見表1），其中雙鏈季銨鹽碘和復(fù)合碘對該菌的殺菌效果最好，殺菌率分別為63.02%（60.14%～65.85%）和43.56%（38.21%～49.01%）。五種消毒劑的抑菌殺菌效果從高到低依次為：雙鏈季銨鹽碘>復(fù)合碘>二氧化氯>大蒜素>聚維酮碘。

2.2 消毒劑對舒伯特氣單胞菌的最小殺菌濃度

雙鏈季銨鹽碘和復(fù)合碘消毒劑的濃度梯度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，當(dāng)濃度為1.1250 mg/L時(shí)，殺菌率為100%。

3 結(jié)論與討論

舒伯特氣單胞菌所引起的內(nèi)臟類結(jié)節(jié)病是鱧科魚類常見疾病之一，舒伯特氣單胞菌對鱧科魚類的養(yǎng)殖存在很大的威脅[10]。聚維酮碘、雙鏈季銨鹽碘、大蒜素、二氧化氯、復(fù)合碘是水產(chǎn)養(yǎng)殖中的常用消毒劑。譚鳳霞和吳全超[11-12]研究表明，聚維酮碘、二氧化氯在低濃度下對氣單胞菌有一定的抑制作用。杜仲大蒜制劑對魚類常見病原菌的抑菌作用中得出大蒜素及制劑對魚害粘球菌、腸型點(diǎn)狀氣單胞菌和熒光假單胞菌均有一定的抑菌作用[13]。在本研究中，當(dāng)濃度0.3750 mg/L時(shí)，五種消毒劑對舒伯特氣單胞菌均有抑制作用;當(dāng)濃度為1.1250 mg/L時(shí)，雙鏈季銨鹽和復(fù)合碘這兩種消毒劑殺菌率均為100%，雙鏈季銨鹽消毒劑在低濃度、短時(shí)間內(nèi)對多重耐藥型革蘭陽性球菌的殺滅效果顯著有關(guān)[14]。雙鏈季銨鹽類化合物是一種陽離子表面活性劑，通過在水中形成帶正電荷的物質(zhì)，吸附于帶負(fù)電荷的微生物表面，形成微團(tuán)，通過滲透作用進(jìn)入細(xì)胞膜的類脂層來改變膜的滲透性，從而達(dá)到殺菌作用[15-18]。復(fù)合碘可釋放出碘分子（I2），氧化菌體蛋白的活性基團(tuán)，并與蛋白中的氨基酸結(jié)合而導(dǎo)致蛋白變性和抑制菌體的代謝酶系統(tǒng)，促使病原體崩解死亡[19]。韋艷等[20]研究表明復(fù)合碘對氣單胞菌的MBC濃度大于512 mg/L，本實(shí)驗(yàn)中復(fù)合碘對舒伯特氣單胞菌的最小殺菌濃度較低，這可能與菌種的不同及其耐藥性有關(guān)。舒伯特氣單胞菌對五種消毒劑的耐藥性有待后續(xù)深入研究。

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