絮凝菌的分離及其復合培養(yǎng)絮凝效果研究

江雨兮

摘? ?要：從土壤中分離出19株具有絮凝活性的菌株，通過初篩和復篩，選取絮凝活性最好的4株構建復合菌，然后進行正交實驗，確定復合菌株最佳絮凝效果的發(fā)酵條件，最后利用得到的復合菌株對印染廢水進行甲基橙脫色處理。

關鍵詞：微生物絮凝劑;發(fā)酵條件優(yōu)化;甲基橙脫色率

沿福州江濱大道散步時，發(fā)現(xiàn)閩江中除了生活及工業(yè)垃圾之外，還廣泛存在會產(chǎn)生異味的微生物污染。目前，處理江水中污染物的方法有：人工打撈、引入污水管截污、自然分解等。水中的污染物Al3+污染環(huán)境，危害水生生物的生長發(fā)育，甚至會導致其死亡[1]，同時通過食物鏈及飲用水等途徑對人體健康造成危害。臨床上鋁中毒主要表現(xiàn)為鋁性腦病，鋁性骨病和鋁性貧血。目前，醫(yī)學上定義的老年癡呆癥是病人腦中鋁質(zhì)量分數(shù)較高所致[2]。在自然界中廣泛存在鐵、錳等重金屬元素，它們是重要的生理微量元素。但如果水中鐵錳的質(zhì)量分數(shù)很高則會導致水的色度升高，并造成危害，如飲用高錳水會慢性中毒，嚴重的話可對人體產(chǎn)生三致毒性作用[3]。

印染廢水是以加工化學纖維及其混紡產(chǎn)品、絲綢為主的印染、毛織染廠及絲綢廠等排出的廢水，含有苯系、萘系、苯胺及聯(lián)苯胺類化合物，具有可生化性差、難降解、致癌、致畸以及對生態(tài)環(huán)境危害嚴重等特點，屬于難處理的工業(yè)廢水之一。這些廢水進入我國水體環(huán)境，成為威脅我國水體環(huán)境的重要因素之一。近年來對印染廢水脫色的研究十分活躍，傳統(tǒng)的處理方法有吸附法、氣浮法、混凝法、膜分離法、氧化法、電化學法、光化學法等，雖然傳統(tǒng)的處理方法已經(jīng)很成熟，但是在處理效果與經(jīng)濟成本上總是無法兼得，因而本文提出可借助絮凝劑實現(xiàn)廢水中的雜質(zhì)沉降。

絮凝劑是一類可以使液體中的不易沉淀固體懸浮顆粒凝聚、沉淀的物質(zhì)。處理廢水工藝中常用絮凝沉淀法。絮凝沉淀法的絮凝劑主要有兩類：有機高分子絮凝劑;無機絮凝劑。無機絮凝劑雖然在運行方面可靠，但處理效率差，費用高，且有二次污染，無法有效地解決問題。因此，急需一種脫色效果好、經(jīng)濟成本低、對環(huán)境友好的脫色方法，而微生物絮凝劑正好符合了這些要求。微生物絮凝劑進行脫色具有成本低、效率高、環(huán)保等優(yōu)點[4]。Kurane和Nohata采用Alcaligennes latus[5]產(chǎn)生的絮凝劑處理了染料廢水，脫色率達到94%。莊源益等[6]選育了對染料有較好絮凝脫色作用的菌株，開發(fā)了對黑染料生產(chǎn)廢水的脫色率為60%的NAT型生物絮凝劑。張蔚平等[7]選育出了有較好脫色作用的菌株，對甲基橙廢水的脫色率為68.4%。近年來對微生物廢水的脫色研究主要集中在選育和培育出各種優(yōu)良的脫色菌株，并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。目前，我國主要從兩個方面研究絮凝劑：一方面是篩選和分離出能夠產(chǎn)絮凝劑的絮凝菌[8-9];另一方面是優(yōu)化絮凝劑產(chǎn)生菌產(chǎn)生絮凝劑的條件[6-10]。主要是對微生物絮凝菌的單一菌株進行研究，對復合型微生物菌株的研究較少[11]。由于各個地方水中微生物種類不同，故需要有針對性地從不同地方的土壤中，培養(yǎng)和提取有效的微生物絮凝菌，大批量、工業(yè)化地培養(yǎng)微生物絮凝菌是不大現(xiàn)實的。

文章結合閩江水源，通過從江畔土壤中篩選出具有較高絮凝率的絮凝劑產(chǎn)生菌株，構建復合菌株，篩選出絮凝活性較高的絮凝菌株，再對它們的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，研究復合絮凝菌對甲基橙廢水的脫色效率。

1? ? 研究的技術路線

復合微生物絮凝菌構建流程：取樣，純化，初篩，復篩，分離，復合，如圖1所示。

2? ? 實驗準備

2.1? 土樣采集

取垃圾箱附近土樣及河邊淤泥中土樣約100 g裝于密封袋中，記錄土樣采集的位置、風向并拍照記錄。

2.2? 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基。

1#：鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）4 g/L;酵母粉0.5 g/L;尿素0.5 g/L;NaCl 0.1 g/L;MgSO4·7H2O 0.2 g/L;KH2PO4 2 g/L;K2HPO4 5 g/L;瓊脂1.5%（w/w）;pH =8.0。

2#：葡萄糖10 g/L;酵母粉0.5 g/L;KH2PO4 2 g/L;K2HPO4 5 g/L;（NH4）2SO4 0.2 g/L;尿素0.5 g/L;NaCl 0.1 g/L;瓊脂1.5%（w/w）;pH= 6.0～7.0。

3#：LB培養(yǎng)基;胰蛋白胨10 g/L;酵母粉5 g/L;NaCl 10 g/L;瓊脂1.5%。

（2）分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L;酵母粉2 g/L;KH2PO4 2 g/L;K2HPO4 5 g/L;（NH4）2SO4 0.2 g/L;尿素0.5 g/L;NaCl 0.1 g/L;瓊脂1.5% ;pH=7.0。

2.3? 儀器

（1）DHG-907 8A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司。

（2）賽多利斯BSA423S精密電子天平，德國賽多利斯集團。

（3）超凈工作臺SW-CJ-IF，蘇凈集團安泰公司。

（4）HERAcell150i全能型CO2細胞培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技。

（5）UV-1100紫外可見分光光度計，上海嘉鵬科技有限公司。

（6）LDZX-50KB立式蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

（7）ZQZY-CF 3層組合式振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司。

3? ? 復合微生物絮凝菌的構建

3.1? 平板初篩

從學校垃圾箱附近土壤及污泥土壤樣品中經(jīng)過富集培養(yǎng)，再用平板分離，共挑取109株表面潮濕、黏稠的單菌落。

3.2? 菌種的初篩

把平板初篩獲得的109株單菌落，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h后，以CaCl2為助凝劑，檢驗以上的各個發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝能力，得到具有絮凝能力的細菌，有絮凝活性的菌株共19株，占挑取的菌落數(shù)的17.3%。如表1所示，其中垃圾堆的土壤中有絮凝活性的菌株較多，河邊泥土中具有絮凝活性的菌株較少。將篩選到的19株具有絮凝活性的菌株編號后保存菌株。由表2可知，C6、L2、L4、L25、N4、H3、H9等7株作為復篩的菌株絮凝率均超過30%作為復篩的備用菌株。

3.3? 菌種的復篩

將表2中7株絮凝活性較高的菌株進行復篩，每株重復3次，結果如表3所示，選出絮凝效果較好的L2、L25、L4、N4進行傳代培養(yǎng)、保存。

4? ? 絮凝菌菌群的構建

將復篩得到的菌株按照等比例（v/v）以2%的接種量混合培養(yǎng)，在37 ℃，150 r/min下培養(yǎng)48 h后，按照測定發(fā)酵液的絮凝活性步驟，得到結果如表4所示。試驗發(fā)現(xiàn)由L2和N4構建的復合菌群的絮凝效果最好，達到79.2%，而單一菌株在同樣的條件下絮凝效果分別是69.5%，53.8%。根據(jù)生態(tài)位理論[13]：在同一個環(huán)境中，生態(tài)位分離的菌株，它們在生長過程中相互利用產(chǎn)生和分泌營養(yǎng)物質(zhì)形成共生關系，產(chǎn)生協(xié)同作用，從而促進絮凝性的提高。本試驗表明形成了共生關系的菌株有L2和N4，它們產(chǎn)生了協(xié)同作用。

4.1? 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

4.1.1? 絮凝菌的生長曲線，培養(yǎng)時間對絮凝率的影響

生長曲線如圖2所示，N4和復合菌群都經(jīng)過了短暫的停滯期，L2的停滯期較長（小于24 h），之后都進入了生長期，其中停滯期L2大于N4和復合菌群。初始階段L2對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件較不適應，經(jīng)過一定的適應期后都能以較快的速度進行生長繁殖。復合菌株和N4在快速生長12 h達到了穩(wěn)定期，菌體數(shù)目增長較為緩慢。而L2在搖床培養(yǎng)大約48 h后也進入了穩(wěn)定期。經(jīng)過穩(wěn)定期后，菌體數(shù)量緩慢地下降，OD值降低，從單株和復合菌株可以分辨出生長過程的各個階段。

實驗在測定菌體生長曲線的同時也測定了菌液的絮凝活性，單一菌株和復合菌株的絮凝活性隨培養(yǎng)時間的延長而發(fā)生變化。結果如圖2～5所示。

根據(jù)酶的生物合成模式[13]進行分析：

（1）由圖3可知，絮凝菌N4在0～24 h處于生長期，到48 h時處于平衡期，48 h之后開始慢慢地衰退。而絮凝率在平衡期時才大量合成，所以屬于滯后合成型。在培養(yǎng)48 h時絮凝率達到最大值55.3%。

（2）由圖4可知，絮凝菌L2在0～48 h處于生長期，在48 h后處于短暫的平衡期，之后處于衰退期。而絮凝率在此期間不斷的增大，到36 h絮凝率達到最大值71.8%，在平衡期時絮凝率逐漸下降，所以屬于同步合成型。

（3）由圖5可知，將這兩株菌種進行復合，在24 h時，絮凝菌處于平衡期，而此時絮凝率還在上升，48 h時達到最大值79.7%，所以經(jīng)過復合，使其合成模式接近于延續(xù)合成型。

4.1.2? 培養(yǎng)基初始pH對絮凝活性的影響

菌體細胞體系的氧化還原電位會被不同初始pH的培養(yǎng)基所改變，從而影響微生物體內(nèi)的酶活性。不同的菌種生長的pH范圍存在差異，產(chǎn)生絮凝劑所需發(fā)酵培養(yǎng)基的pH也不一樣。由圖6～8可知，絮凝活性隨著pH的增大先增大后減小。

（1）N4在pH為6.0～8.0有較好的絮凝活性，最適pH=8.0。

（2）L2在pH為6.0～9.0絮凝活性較好，在pH=8.0絮凝率最大。

（3）復合菌在pH為6.0～9.0時絮凝活性較好，也是在pH=8.0時，絮凝率達到最大為85.8%，當pH=4.0和pH=10.0時絮凝活性最低。

復合菌在培養(yǎng)基的初始pH為中性偏堿的環(huán)境中所產(chǎn)絮凝劑的效率更高，在強酸和強堿條件下所產(chǎn)的絮凝劑效率低。

4.1.3? 培養(yǎng)溫度對絮凝活性的影響

培養(yǎng)溫度明顯影響著微生物積累絮凝劑。溫度是影響有機體生長與存活的重要因素。在一定范圍內(nèi)，機體的代謝活動與生長繁殖才會隨著溫度的上升而增加。而且酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，高溫受熱時容易失活，過高或過低的溫度均可能導致菌體內(nèi)酶系統(tǒng)的作用方式發(fā)生轉化，從而使微生物的代謝方式發(fā)生改變。

（1）由圖9～10可知，N4和L2以及復合后的菌株變化趨勢相似，溫度由22 ℃升到30 ℃時，絮凝率逐漸升高，到30 ℃時，絮凝率達到最大值，N4的絮凝率為80.9%，L2的絮凝率為80.8%。

（2）由圖11可知，復合培養(yǎng)菌的絮凝率達到86.6%。溫度到30 ℃之后有所下降。38 ℃之后絮凝率下降得最快，由此可知，溫度過高或過低都不適合酶的合成，較適合的培養(yǎng)溫度為26～34 ℃，其中30 ℃為最佳培養(yǎng)溫度，酶的活性最高。

4.2? 培養(yǎng)條件的正交優(yōu)化實驗

根據(jù)以上單因素試驗的結果，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度對實驗結果有較顯著的影響，它們之間可能存在交互作用，所以需要在單因素實驗的基礎上進一步采用正交實驗優(yōu)化培養(yǎng)條件。實驗采用L9（34）方案法來設計正交實驗。相對應的3個因素取為培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基初始pH，每個因素考察3個水平，通過9組正交培養(yǎng)實驗，優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，正交實驗因素水平如表5所示。

由正交試驗結果表6可知，最合適的培養(yǎng)條件是培養(yǎng)溫度30 ℃，培養(yǎng)時間60 h，培養(yǎng)基的初始pH=7.0。絮凝率達到85.0%。模擬污泥的高嶺土懸濁液液體呈白色混濁狀，而加入復合菌后，液體澄清如圖12所示。

對正交實驗結果進行方差分析，得到結論：培養(yǎng)時間對絮凝活性的影響最大，在穩(wěn)定期時絮凝效果較好（見表7）。pH在偏堿性環(huán)境條件下較適于復合菌產(chǎn)生絮凝物質(zhì)，各因素對微生物絮凝劑絮凝效果影響程度大小的順序為：培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度。

4.3? 對甲基橙廢水的處理

在裝有100 mL，pH=7.0的發(fā)酵液的250 mL三角瓶中，接入復篩得到的菌株，按照等比例（v/v）以2%的接種量混合培養(yǎng)，在30 ℃下培養(yǎng)60 h后，測其對甲基橙廢水的脫色率。將1 mL培養(yǎng)液加入甲基橙廢水中，振蕩，使廢水和培養(yǎng)廢水充分混合，廢水逐漸變渾濁，放置一段時間后顏色逐漸變淺，測其脫色率為25%。說明絮凝菌具有一定的脫色效果。

5? ? 結語

選取學校垃圾箱旁邊的土以及河邊的淤泥為材料，以高嶺土懸浮液進行絮凝效果的測定，篩選出絮凝效果好的菌株進行復合，并對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結果顯示：從平板中分離出109株表面潮濕、黏稠的單菌落，經(jīng)過初篩，復篩得到絮凝活性最好的菌L2、L4、L25、N4;最后得到以L2和N4構建的復合菌群絮凝效果最佳。最后通過正交實驗確定復合菌的最佳發(fā)酵條件為：在60 h發(fā)酵培養(yǎng)時間內(nèi)，培養(yǎng)基的初始pH=7.0，發(fā)酵溫度為30 ℃時絮凝效果最好。利用甲基橙測試絮凝菌的脫色率為25%。

目前，我國微生物絮凝劑應用于實際的工程比較少，研制和應用部分還處于初始階段。微生物絮凝劑作為一種新型的水處理劑，具有安全、高效、可生物降解、不污染環(huán)境、可消除二次污染等特點，擁有了其他絮凝劑無法比擬的優(yōu)點，微生物絮凝劑取代大部分傳統(tǒng)的無機和合成有機高分子絮凝劑將成為一種趨勢。從土壤中篩選出具有良好絮凝效果的絮凝菌，為環(huán)境中污水處理提供了一定的菌種資源，為廉價絮凝菌種的開發(fā)利用提供參考。

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