生物標(biāo)志物與抗腫瘤藥物研發(fā)

吳家睿

腫瘤患者廣泛存在著個(gè)體之間的差異以及個(gè)體的腫瘤組織內(nèi)部差異，需要通過(guò)生物標(biāo)志物來(lái)區(qū)分和確定對(duì)藥物具不同響應(yīng)的個(gè)體。因此，生物標(biāo)志物在抗腫瘤藥物研發(fā)中起著重要的作用。

抗腫瘤藥物研發(fā)是當(dāng)前創(chuàng)新藥物研發(fā)最活躍的領(lǐng)域，也是生物標(biāo)志物最能夠體現(xiàn)“英雄用武”之領(lǐng)域。腫瘤患者不僅廣泛存在著個(gè)體異質(zhì)性（inter-tumor?heterogeneity），而且在每個(gè)個(gè)體的腫瘤組織中也普遍存在內(nèi)部差異（intra-tumor?heterogeneity），因此需要通過(guò)生物標(biāo)志物來(lái)區(qū)分和確定對(duì)藥物具不同響應(yīng)的個(gè)體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，如果在腫瘤臨床試驗(yàn)中納人正確的生物標(biāo)志物，可將藥物最終獲批的可能性提高10%到25%。

美國(guó)食品與藥品管理局（Foodand?Drug?Administration，F(xiàn)DA）在2018年度批準(zhǔn)了多個(gè)基于伴隨診斷的腫瘤分子靶向藥物，例如用于治療攜帶ALK（間變性淋巴瘤激酶）基因重組的非小細(xì)胞肺癌的藥物勞拉替尼（lorlatinib）。隨后FDA又進(jìn)一步推出一項(xiàng)伴隨診斷分類標(biāo)簽指南草案，主要針對(duì)個(gè)體化抗腫瘤藥物伴隨診斷的分類標(biāo)簽，即在特定情況下，如果試驗(yàn)證據(jù)足以證明某一伴隨診斷產(chǎn)品適用于一組或一類治療藥物，則該診斷產(chǎn)品的預(yù)期用途或適應(yīng)證將涵蓋這一類藥物，而不限于單個(gè)藥物。這表明FDA已經(jīng)把生物標(biāo)志物視為抗腫瘤藥物研發(fā)和應(yīng)用的主要基礎(chǔ)。

最主要的腫瘤生物標(biāo)志物：基因變異

腫瘤的形成和發(fā)展源于大量的基因變異，每種類型的腫瘤往往都具有成百上千的基因變異。因此，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞基因組的DNA序列變異被公認(rèn)是抗擊腫瘤的關(guān)鍵。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National?Institutes?of?Health，NIH）在2006年啟動(dòng)了一個(gè)名為“癌癥基因組圖集”（The?Cancer?Genome?Atlas，TCGA）的項(xiàng)目，通過(guò)該項(xiàng)目的實(shí)施，已在肺癌、乳腺癌等50種癌癥的上萬(wàn)個(gè)樣本中發(fā)現(xiàn)近1000萬(wàn)種遺傳變異。目前學(xué)術(shù)界達(dá)成這樣一個(gè)共識(shí)：防治腫瘤的首要任務(wù)是了解腫瘤細(xì)胞的基因變異。

美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（National?Cancer?Institute，NCI）在2017年進(jìn)行了一次全國(guó)癌癥精確醫(yī)學(xué)問(wèn)卷調(diào)查（National?Survey?of?Precision?Medicinein?Cancer?Treatment），調(diào)查結(jié)果顯示：在參加調(diào)查的美國(guó)腫瘤醫(yī)生中，高達(dá)75.6%的人都在用“二代測(cè)序”（next-generation?sequencing，NGS）技術(shù)指導(dǎo)腫瘤治療，其中34.0%的醫(yī)生經(jīng)常使用NGS檢測(cè)來(lái)指導(dǎo)晚期難治性腫瘤患者的治療決定，29.1%的醫(yī)生通過(guò)NGS檢測(cè)決定腫瘤患者是否滿足臨床試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，17.5%的醫(yī)生用NGS檢測(cè)來(lái)決定是否進(jìn)行超適應(yīng)證用藥。

基因測(cè)序目前已成為一個(gè)巨大的產(chǎn)業(yè)。根據(jù)美國(guó)聯(lián)合市場(chǎng)研究機(jī)構(gòu)在2017年年底發(fā)布的分析報(bào)告，2016年全球DNA測(cè)序市場(chǎng)產(chǎn)值約為52億美元，預(yù)計(jì)2023年將達(dá)到183億美元。顯然，腫瘤患者的基因檢測(cè)需求在這個(gè)測(cè)序市場(chǎng)中占有重要的份額。例如，美國(guó)已經(jīng)有數(shù)百萬(wàn)女性接受了抑癌基因BRCA1的基因變異檢測(cè)，以判定個(gè)體患乳腺癌或卵巢腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)程度。此外，越來(lái)越多的腫瘤基因檢測(cè)產(chǎn)品進(jìn)人臨床應(yīng)用領(lǐng)域。例如，2017年12月，美國(guó)FDA批準(zhǔn)首個(gè)腫瘤基因檢測(cè)盒上市，這款由波士頓一家名為Foundation?Medicine生物公司制造的產(chǎn)品“Foundation?One?CDx"，可通過(guò)對(duì)324個(gè)特定腫瘤基因的深度測(cè)序來(lái)檢測(cè)變異情況.對(duì)肺癌、乳腺癌、直腸癌和卵巢癌等四種常見(jiàn)惡性腫瘤進(jìn)行早期診斷。

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，基因測(cè)序技術(shù)也正在發(fā)生著重大的改進(jìn)。由于NGS技術(shù)的測(cè)定序列“讀長(zhǎng)”較短，通常在200～300堿基對(duì);研究者又開(kāi)發(fā)出第三代測(cè)序技術(shù)，其“讀長(zhǎng)”平均可達(dá)10千堿基對(duì)以上。研究者利用第三代測(cè)序技術(shù)能夠進(jìn)一步揭示腫瘤細(xì)胞基因組的變異特征和復(fù)雜性。例如在一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的測(cè)序工作中，研究者利用第三代測(cè)序技術(shù)鑒定出17313個(gè)長(zhǎng)度大于50堿基對(duì)的基因組結(jié)構(gòu)變異，包括插入、缺失、重復(fù)、倒位和其他特殊變異類型;而用NGS技術(shù)只檢測(cè)到4174個(gè)基因組結(jié)構(gòu)變異”?？梢?jiàn)第三代測(cè)序技術(shù)在基因組結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)上具有更高的靈敏度與準(zhǔn)確度。

雖然研究者利用先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞中大量的基因變異，但是對(duì)這些基因變異的生物學(xué)意義或在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的病理機(jī)制方面仍知之甚少。例如研究者已經(jīng)在與乳腺癌或卵巢癌高度相關(guān)的抑癌基因BRCA1的13個(gè)外顯子上發(fā)現(xiàn)近4000種單核苷酸變異（single-nucleotide?variant，SNV），但大部分SNV的生物學(xué)含義或者在癌變中的作用并不很清楚。不久前研究者采用CRISPR一Cas9基因組編輯技術(shù)系統(tǒng)性地評(píng)估了整個(gè)BRCA1的外顯子序列上幾乎所有的SNV，鑒定出400多個(gè)SNV是非功能性錯(cuò)義突變（non-functional?missense?mutation），同時(shí)發(fā)現(xiàn)了能抑制BRCA1表達(dá)的近300個(gè)SNV?？梢哉J(rèn)為，確定基因變異在腫瘤形成中的作用依然是當(dāng)前基因檢測(cè)領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)。

需要指出的是，即使知道了腫瘤細(xì)胞里基因突變的作用或功能，也并不意味著能給患者帶來(lái)益處。一項(xiàng)對(duì)5000多例非小細(xì)胞肺癌患者的基因檢測(cè)方式與生存率的相關(guān)性研究揭示，那些接受了30種基因以上的“廣譜基因”檢測(cè)的患者與只接受了單純的EGFR/ALK檢測(cè)的患者，在12個(gè)月生存率上沒(méi)有顯著差異3。研究者發(fā)現(xiàn)，除了針對(duì)EGFR/ALK相關(guān)的靶向治療外，在攜帶其他類型基因突變的患者中只有4.5%的人得到相應(yīng)的靶向治療3。換句話說(shuō)，檢測(cè)到了有臨床意義的突變不等于獲得了有效的治療藥物。當(dāng)前的基因檢測(cè)能力已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)人們研發(fā)靶向藥物的能力。

追蹤腫瘤動(dòng)態(tài)變化的利器：液體活檢

腫瘤最具挑戰(zhàn)性的特點(diǎn)除了高度異質(zhì)性之外就是高度可變性，即腫瘤細(xì)胞隨著病程或者治療過(guò)程時(shí)刻發(fā)生著各種各樣的變化。這種特點(diǎn)使得傳統(tǒng)的病理診斷或者影像診斷難以滿足腫瘤治療的需求，迫切需要一個(gè)能夠無(wú)創(chuàng)地動(dòng)態(tài)跟蹤腫瘤細(xì)胞變化的檢測(cè)技術(shù)。液體活檢技術(shù)就是一種能滿足這種需求的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可能是近年來(lái)在臨床上，尤其在腫瘤診治領(lǐng)域發(fā)展最快的檢驗(yàn)方法，曾被《麻省理工科技評(píng)論》評(píng)為“2015年十大突破技術(shù)”。該技術(shù)通過(guò)非侵入性方式檢測(cè)血液或尿液等體液中特定的生物標(biāo)志物，從而對(duì)癌癥等疾病做出相應(yīng)的診斷。目前腫瘤液體活檢的分析重點(diǎn)是血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating?tumor?cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating?tumor?DNA，ctDNA），以及腫瘤細(xì)胞分泌的含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的囊泡狀外泌體（exosome）。

對(duì)血液中的CTC和ctDNA進(jìn)行檢測(cè)是目前臨床應(yīng)用中最常見(jiàn)的液體活檢形式，尤其是ctDNA，它作為監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程和藥物響應(yīng)的生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。首先，通過(guò)對(duì)ctDNA的分析，能夠獲得腫瘤基因組的綜合性信息，并找到在病理組織活檢中常常無(wú)法發(fā)現(xiàn)的體細(xì)胞突變，從而用于判斷腫瘤對(duì)藥物的敏感性或耐藥性。比如從非小細(xì)胞肺癌患者的ctDNA中檢測(cè)到EGFR基因突變，就可用于指導(dǎo)臨床用藥。此外，通過(guò)對(duì)ctDNA的深度測(cè)序，可以發(fā)現(xiàn)只在部分腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)的基因突變，從而有助于解決腫瘤組織的內(nèi)部異質(zhì)性問(wèn)題。

雖然液體活檢技術(shù)在臨床上得以迅速推廣，但該方法的臨床有效性并沒(méi)有得到很好的研究。美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)和美國(guó)病理醫(yī)師學(xué)會(huì)，針對(duì)已發(fā)表的1338篇關(guān)于ctDNA臨床檢測(cè)的論文，從分析有效性（analytical?validity）、臨床有效性（clinical?validity）和臨床實(shí)用性（clinical?utility）三方面進(jìn)行了系統(tǒng)分析15]。分析結(jié)果指出：目前發(fā)表的與ctDNA分析有效性相關(guān)的研究都是通過(guò)比較腫瘤組織和血漿中致病突變的一致性得出結(jié)論，但實(shí)際上有很多生物學(xué)因素也會(huì)影響這種一致性;雖然ctDNA檢測(cè)到的陽(yáng)性結(jié)果可以用于指導(dǎo)臨床治療，但是檢測(cè)結(jié)果為陰性的患者仍然需要進(jìn)行腫瘤組織檢測(cè)，因?yàn)檫@類患者在組織病理檢測(cè)中可能是陽(yáng)性結(jié)果。所以，盡管當(dāng)前研究者很看重ctDNA的檢測(cè)潛力，但是在付諸日常臨床實(shí)踐時(shí)，尚需要更多的臨床有效性證據(jù)。

液體活檢技術(shù)除了關(guān)注血液中的CTC和ctDNA外，還涉及血液中RNA和蛋白質(zhì)等其他組分。血液蛋白質(zhì)在過(guò)去的臨床實(shí)踐中已被視為重要的生物標(biāo)志物來(lái)源，其中就有數(shù)十種腫瘤抗原或腫瘤分泌蛋白被廣泛用于診斷腫瘤發(fā)生或判斷治療效果和預(yù)后，近年來(lái)研究人員利用蛋白質(zhì)組技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展出針對(duì)血液蛋白質(zhì)的液體活檢技術(shù)。顯然，如何將血液中各種組分充分用于腫瘤液體活檢是研究者需要認(rèn)真考慮的問(wèn)題。

腫瘤的分子分型：基于生物標(biāo)志物的兩種策略

傳統(tǒng)的腫瘤分類是基于解剖位置和病理性狀，屬于“粗放型”。由于腫瘤存在高度的異質(zhì)性，相似病理形態(tài)的腫瘤往往表現(xiàn)出不同的臨床癥狀和不同的藥物響應(yīng)。隨著精確醫(yī)學(xué)的出現(xiàn)，研究者逐漸將基因和蛋白質(zhì)等生物大分子作為腫瘤分類的基礎(chǔ)。其中，分子分型的結(jié)果在抗腫瘤藥物的研發(fā)中發(fā)揮了重要作用。例如，在原創(chuàng)藥拉羅替尼（larotrectinib）[原肌球蛋白受體激酶（TRK）的小分子抑制劑]的臨床試驗(yàn)中，人選的患者涉及13種不同的實(shí)體瘤類型，但每位患者都有一個(gè)共同的分子標(biāo)志物——TRK基因的融合變異。

目前腫瘤細(xì)胞的基因變異信息是腫瘤分子分型最常用的分子標(biāo)志物;美國(guó)在啟動(dòng)TCGA項(xiàng)目時(shí)，從其名稱就可看到是把腫瘤的分類目標(biāo)定在腫瘤細(xì)胞的基因組測(cè)序上。但是，研究者很快就認(rèn)識(shí)到，單一的基因變異分子特征很難應(yīng)用于大部分癌癥類型。隨著TCGA項(xiàng)目的推進(jìn)，美國(guó)NCI又啟動(dòng)了一個(gè)針對(duì)腫瘤蛋白質(zhì)組的項(xiàng)目——“The?Clinical?Proteomic?Tumor?Analysis?Consortium”（CPTAC），不僅要獲得腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，而且要把基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)整合在一起進(jìn)行分析。研究者為此專門(mén)創(chuàng)造了一個(gè)詞“蛋白質(zhì)組一基因組學(xué)”（proteogenomics）。該項(xiàng)目的第一篇研究論文于2014年發(fā)表。在此項(xiàng)研究中，研究者首先將已被TCGA進(jìn)行過(guò)基因組測(cè)序的95個(gè)人類結(jié)直腸癌樣本做了蛋白質(zhì)組分析，然后將這些蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)和對(duì)應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，進(jìn)而更完整地揭示了這些腫瘤細(xì)胞的分子特性。

隨著研究工作的深人，人們發(fā)現(xiàn)不同類型的生物大分子乃至其化學(xué)修飾在腫瘤鑒定和分類中都有著特定的價(jià)值。例如不久前發(fā)表的一項(xiàng)工作，利用改進(jìn)的液體活檢技術(shù)分析血液中游離DNA（cell-free?DNA，cfDNA）的甲基化信息，成功進(jìn)行了早期腫瘤檢測(cè)，并做了正確的分類。

顯然，要實(shí)現(xiàn)腫瘤的精確分子分型，并用來(lái)指導(dǎo)個(gè)性化抗腫瘤藥物的研發(fā)，研究者必須改變那種依賴于單一類型生物標(biāo)志物乃至單個(gè)分子標(biāo)志物的簡(jiǎn)單化思路，發(fā)展基于多個(gè)生物標(biāo)志物指標(biāo)的整合型評(píng)估技術(shù)，即通過(guò)建立特定的評(píng)估模型，確定不同指標(biāo)之間的權(quán)重分配.進(jìn)行多指標(biāo)相互關(guān)聯(lián)分析，從而確定個(gè)體患者的腫瘤分子特征、預(yù)測(cè)其可能的藥物響應(yīng)情況。例如，TCGA項(xiàng)目的研究者在腫瘤分子分型方面，不僅利用了腫瘤細(xì)胞基因組序列的信息，而且還整合了相關(guān)的染色體非整倍性、DNA甲基表達(dá)譜、基因表達(dá)譜、microRNA表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜等數(shù)據(jù)，從而將傳統(tǒng)分類確定的33種腫瘤類型按照這種多組學(xué)整合的分子分型方法分為28種類型。

腫瘤分子分型的目標(biāo)，不僅要找出具有相同病理形態(tài)的腫瘤的不同分子特征，還要提煉出不同病理形態(tài)的特定類型腫瘤的共同分子特征，即構(gòu)造出一種稱為“泛腫瘤”（pan-cancer）的類型。不久前，美國(guó)研究人員采集了近1700例年齡20歲或以下的包括6種白血病和實(shí)體瘤的青少年腫瘤（paediatric?cancers）樣本，檢測(cè)了其全基因組、全外顯子組和轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)了一系列青少年腫瘤基因組所共有的特征，比如在這些樣本中找到142個(gè)驅(qū)動(dòng)基因，其中只有45%能夠在成人各種類型的腫瘤中找到。又例如，研究者收集了卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌.宮頸癌、子宮肌瘤和乳腺癌共2500多例樣本，對(duì)這些樣本的基因組、表觀遺傳組、轉(zhuǎn)錄組以及蛋白質(zhì)組等多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整合，發(fā)現(xiàn)了16種與臨床相關(guān)的分子特征，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了泛婦科腫瘤綜合分子分型，得到與預(yù)后和靶向治療顯著相關(guān)的5種分子亞型。

由此可以看出腫瘤分子分型的兩種主要策略：基于特定分子標(biāo)志物的“跨瘤種”分子分型，以及基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合的“泛腫瘤”分子分型。前者注重不同腫瘤類型間的分子個(gè)性特征，后者注重具有特定生物學(xué)共性（如“青少年腫瘤”或“婦科腫瘤”）的不同腫瘤類型間的分子綜合信息。兩者都超越了基于組織病理形態(tài)特征的傳統(tǒng)腫瘤分類，從分子層面去揭示各種類型腫瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系。

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